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鸡白细胞介素2原核表达及多克隆抗体的制备 被引量:5
1
作者 于涟 谢荣辉 +2 位作者 卢觅佳 黄耀伟 李建荣 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期10-13,共4页
鸡白细胞介素2(IL-2)是一种在机体免疫调节中具有多种功能的细胞因子。本研究将萧山鸡白细胞介素2基因克隆入原核表达载体pET-28b,获得了重组表达载体pET-28b-IL-2,将此重组表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达萧山鸡IL-2。SDS-PAG... 鸡白细胞介素2(IL-2)是一种在机体免疫调节中具有多种功能的细胞因子。本研究将萧山鸡白细胞介素2基因克隆入原核表达载体pET-28b,获得了重组表达载体pET-28b-IL-2,将此重组表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达萧山鸡IL-2。SDS-PAGE结果表明,萧山鸡IL-2在大肠杆菌中得到了表达,以此表达产物制成油乳剂苗免疫家兔,用ELISA和Westernblotting检测兔血中的多克隆抗体,结果均为阳性。因而为进一步开展鸡IL-2的结构和功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 制备 白细胞介素2 原核表达 多克隆抗体 免疫增强剂
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鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达 被引量:12
2
作者 龚婷 杨孝朴 +3 位作者 李银聚 张春杰 吴庭才 程相朝 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期11-14,40,共5页
根据已发表的鸡白介素-2(ChIL-2)cDNA编码基因序列设计3条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429 bp的ChIL-2全长基因cDNA和363 bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA.将ChIL-2全长和去信号肽的基因cDNA分别克隆到原核... 根据已发表的鸡白介素-2(ChIL-2)cDNA编码基因序列设计3条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429 bp的ChIL-2全长基因cDNA和363 bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA.将ChIL-2全长和去信号肽的基因cDNA分别克隆到原核表达载体pET28a(+),构建原核重组表达质粒pET28a-IL-2和pET28a-△SIL-2,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,在22 ku和18 ku处有2条清晰的蛋白带,相同条件下pET28a-△SIL-2表达量较高.RNAstructure软件分析表明,pET28a-IL-2的mRNA5′端序列形成了复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在原核细胞中的表达有一定的影响. 展开更多
关键词 细胞白介素 IL-2基因 信号肽 原核表达 MRNA二级结构
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鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 被引量:2
3
作者 刘一尘 张春杰 +4 位作者 程相朝 张谦 李银聚 吴庭才 赵战勤 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2009年第2期110-113,共4页
应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,... 应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡IL-18成熟蛋白基因 原核表达 多克隆抗体
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rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化 被引量:1
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作者 杨立彬 李树蕾 +2 位作者 谭岩 许淑芬 汪军 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期415-419,共5页
目的:构建人肿瘤坏死因子样分子1A(TL1A)原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法:人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大... 目的:构建人肿瘤坏死因子样分子1A(TL1A)原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法:人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15[pREP4]。IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)纯化靶蛋白。结果:目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15[pREP4]经IPTG诱导表达相对分子质量约22 000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合。结论:成功地构建了重组原核表达质粒pQE-Tl1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白。 展开更多
关键词 TUA 克隆 分子 原核表达 蛋白质纯化
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人肝细胞癌相关抗原661基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化 被引量:1
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作者 李树蕾 谭岩 +3 位作者 刘力华 段秀梅 方艳秋 许淑芬 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期899-902,共4页
目的:构建人肝细胞癌相关抗原661(Hepatocellular carcinoma-associated antigens661,HCA661)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法:人肝细胞癌SMMC7721细胞基因组DNA经PCR扩增HCA661基因,克隆到pGEM-Teasy中进行酶切、PC... 目的:构建人肝细胞癌相关抗原661(Hepatocellular carcinoma-associated antigens661,HCA661)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法:人肝细胞癌SMMC7721细胞基因组DNA经PCR扩增HCA661基因,克隆到pGEM-Teasy中进行酶切、PCR和测序鉴定;构建重组质粒pQE-HCA661,并转化大肠杆菌M15[pREP4],经IPTG诱导表达目的蛋白;镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)纯化靶蛋白后进行Western blot鉴定。结果:目的基因经酶切和PCR鉴定结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GeneBank登录的序列完全一致;工程化大肠杆菌M15[pREP4]经IPTG诱导表达约39kD的目的蛋白。Western blot鉴定结果显示,纯化重组蛋白能够分别与抗His单克隆抗体和抗HCA661多克隆抗体特异性结合。结论:本实验成功地构建了重组原核表达质粒pQE-HCA661,工程菌表达的重组HCA661带有6×His标签,并具有免疫原性,可以用于制备单克隆抗体,或用于检测患者血清中肝细胞癌抗体以预测肿瘤恶性程度。 展开更多
关键词 人肝细胞癌相关抗原661 基因克隆 原核表达 蛋白纯化 免疫原性
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拟南芥血红蛋白1(AtGLB1)与过氧化氢的相互作用 被引量:2
6
作者 杨礼香 王正询 +1 位作者 柯德森 巫锦雄 《氨基酸和生物资源》 CAS 2009年第4期1-4,16,共5页
拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)属于非共生的血红蛋白。在低氧胁迫中对植物细胞中过氧化氢(H2O2)内稳态的维持起了很重要的作用。为了检测AtGLB1与H2O2能否直接相互作用,我们扩增了拟南芥的AtGLB1基因,并将其克隆到原核表达质粒pET32a中,测... 拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)属于非共生的血红蛋白。在低氧胁迫中对植物细胞中过氧化氢(H2O2)内稳态的维持起了很重要的作用。为了检测AtGLB1与H2O2能否直接相互作用,我们扩增了拟南芥的AtGLB1基因,并将其克隆到原核表达质粒pET32a中,测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导目的蛋白表达后,镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)纯化了靶蛋白。体外表达的氧合的AtGLB1能与H2O2直接相互作用。因此,与H2O2反应可能是AtGLB1清除低氧胁迫下产生的H2O2的一种方式。 展开更多
关键词 拟南芥的血红蛋白1 原核表达 H2O2 反应
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肿瘤坏死因子相关凋亡受体(TRAIL)cDNA的克隆及高效表达 被引量:1
7
作者 陈宜顶 闫长伟 +1 位作者 王联结 刘丽 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期64-68,共5页
为了得到人TRAILcDNA并克隆到pGEM TVector。利用PCR技术获得目的基因片段 ,通过原核表载体pBV2 2 0构建人TRAIL表达质粒。将所得表达质粒转化宿主菌DH5α ,培养至OD60 0 值到达 0 6时 42℃诱导表达 ,并通过SDS PAGE分析表达结果。经... 为了得到人TRAILcDNA并克隆到pGEM TVector。利用PCR技术获得目的基因片段 ,通过原核表载体pBV2 2 0构建人TRAIL表达质粒。将所得表达质粒转化宿主菌DH5α ,培养至OD60 0 值到达 0 6时 42℃诱导表达 ,并通过SDS PAGE分析表达结果。经凝胶薄层扫描 ,对pBV TRAILD DH5α工程菌热诱导 5h ,TRAIL衍生物蛋白的表达量最高约占菌体可溶性总蛋白的 31 %。人TRAIL基因 ,通过pBV2 2 展开更多
关键词 TRAIL RT-PCR 基因克隆 原核表达
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人黑色素瘤抗原MAGE-3肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性的观察
8
作者 宋淑霞 刘贵然 +2 位作者 郑龙 王俊霞 刘福英 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期739-742,共4页
目的通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗,并观察其对HLA-A*0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法用RT-PCR的方法,从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段,分别将其插入到pcDNA3.1/V5-His真核和pET32a原... 目的通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗,并观察其对HLA-A*0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法用RT-PCR的方法,从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段,分别将其插入到pcDNA3.1/V5-His真核和pET32a原核表达载体。将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达;将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况。并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。然后,采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HLA-A*0201转基因小鼠,LDH方法检测CTL活性。结果酶切结果证实,成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体,并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达,原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体。用DNA疫苗进行初次免疫,镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后,可成功地诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性。结论成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原,为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础。 展开更多
关键词 肿瘤抗原MAGE-3 真核/原核表达 HL-A*0201转基因小鼠 CTL活性
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真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN 和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN构建
9
作者 柴云 于明 朱颖 《蚌埠医学院学报》 CAS 2019年第11期1437-1440,共4页
目的:构建人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法:根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-F... 目的:构建人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法:根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-Flag和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA3.1-Flag-PTEN转染到HEK 293细胞,将pGEX-6P-1-GST-PTEN转到E.coli BL-21中,通过Western blotting和考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。结果:PCR显示目的基因插入成功;DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变;Western blotting和考马斯亮蓝染色法证实融合质粒可以在生物体内正确表达。结论:成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为PTEN在帕金森疾病中的机制研究奠定了基础。 展开更多
关键词 抑癌蛋白 人第10号染色体缺失的磷酸酶 真核 原核 克隆构建 重组表达
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Elementary study on the antigenicity of SARS-CoV Mc region
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作者 ZU QIONG HU WEI ZHAO +5 位作者 WEN BING ZHANG HUI JUN WAN LI FANG JIANG ZHI WEI LIU ZHI HUA LIU BEI GUO LONG 《Journal of Microbiology and Immunology》 2006年第3期177-181,共5页
To test the antigenic activity of M protein (Mc protein) in the inner membrane of SARS-CoV, SARS-CoV Mc protein's bases locating inside the membrane were cloned, the His-fusion protein was expressed in E. coli and... To test the antigenic activity of M protein (Mc protein) in the inner membrane of SARS-CoV, SARS-CoV Mc protein's bases locating inside the membrane were cloned, the His-fusion protein was expressed in E. coli and analyzed for its antigenic activity. Among those 7 clinically diagnosed patients' sera , there were 5 positive and 2 negative in reaction with His-fusion protein. All of the 20 healthy persons' sera and rabbit anti-OC43 and 229E were of negative reaction with His-fusion protein. The animals immunized with His-fusion protein have produced multi-clonal antibody. The His-fusion protein could specially react with clinically diagnosed SARS patients' sera and the animals immunized with His-fusion protein could produce specifically multi-clonal antibody, but it could not react with the sera of healthy persons and the rabbit anti-OC43 and 229E. 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合症 SARS-CoV病毒 Mc区 抗原性
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SARS冠状病毒膜蛋白膜内区的表达、纯化及抗原性初步研究
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作者 胡族琼 龙北国 +5 位作者 张文炳 晏辉钧 江丽芳 刘志伟 刘志华 赵卫 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期1-4,共4页
目的对SARS冠状病毒膜蛋白膜内区基因片段进行克隆表达和表达产物的纯化复性,探讨该表达蛋白的抗原特性。方法克隆SARS冠状病毒GD322株膜蛋白膜内区,在原核表达系统中表达His-融合蛋白,采用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)... 目的对SARS冠状病毒膜蛋白膜内区基因片段进行克隆表达和表达产物的纯化复性,探讨该表达蛋白的抗原特性。方法克隆SARS冠状病毒GD322株膜蛋白膜内区,在原核表达系统中表达His-融合蛋白,采用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析His-融合蛋白抗原特性。结果7份SARS临床诊断患者血清中5份血清能与His-融合蛋白反应,2份不与之反应。兔抗OCA3、229E血清及20份健康人血清皆不与His-融合蛋白反应。His-融合蛋白免疫动物可产生多克隆抗体。结论本研究获得的His-融合蛋白可与SARS临床诊断患者血清特异性结合,可免疫动物获得特异性多抗;但不与健康人血清及兔抗OCA3、229E血清发生特异性结合。 展开更多
关键词 SARS冠状病毒 膜蛋白 原核表达 抗原活性
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