人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析

目的:以原核表达的人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)为免疫原制备多克隆抗体,检测LYZL4在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供依据。方法:将LYZL4编码基因克隆于原核表达载体pET32a,IPTG诱导重组LYZL4(r LYZL4)表达。分别使用Ni-NTA树脂和甲壳素亲和层析纯化rLYZL4,采用双层琼脂平板扩散法检测杀菌活性。以Ni-NTA树脂纯化产物为免疫原制备兔抗rLYZL4多克隆抗体,通过ELISA测定抗体效价,Western印迹检测抗体特异性后,检测LYZL4蛋白在人体各组织的分布及其在精子和精浆中存在情况,免疫组化确认LYZL4在人睾丸组织中的定位。结果:原核表达系统可有效表达rLYZL4,其对溶壁微球菌及大肠杆菌无杀灭活性。制备的兔抗rLYZL4多克隆抗体具有很高的效价和特异性,在睾丸、附睾及人精子蛋白提取物中可检测到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圆形精子细胞及长形精子细胞的顶体上。结论:本研究成功以原核表达的rLYZL4制备了该蛋白的多克隆抗体,确认LYZL4在睾丸和附睾有表达,并定位于精子顶体上,提示其可能与顶体结构或功能相关。

鸭抗原相关转运体TAP1和TAP2原核表达及多克隆抗体的制备

HBK鸭是国家禽类实验动物种子中心培育的我国首个无特定病原体(SPF)鸭,已封闭饲养9个世代。鸭抗原处理相关转运体(TAP)基因位于主要组织相容性复合体区域,TAP1和TAP2组成的二聚体具有将抗原肽从细胞质转运入内质网腔的重要作用。为了表达鸭抗原相关转运体蛋白,并制备特异性多克隆抗体,试验采用PCR方法扩增HBKB系鸭的TAP1完整基因和TAP2基因的预测肽结合区(PBD),分别命名为TAP1和TAP2PBD,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒p ET-TAP1和p ET-TAP2PBD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDSPAGE及Western-blot鉴定,表达产物经SDS-PAGE后分别切胶免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明:两种目的蛋白均获得了正确表达。说明试验制备了高特异性鸭TAP1和TAP2多克隆抗体,可用于水禽TAP的结构和功能研究。

草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.

炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达及其多克隆抗体的制备

原核表达炭疽杆菌保护性抗原受体结合区并制备该蛋白的多克隆抗体。从炭疽芽胞杆菌A16R中经PCR扩增得到了炭疽菌保护性抗原(PA)受体结合区基因,即PA的第四结构域(PA-D4),将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-2b(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrapTM Chelating HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western blot检测抗血清。结果表明,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对PA-D4融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1∶102400;其抗体能特异性识别内源性的PA。PA-D4重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能和炭疽疫苗免疫保护机制奠定了基础。

巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过Em IMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备,为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先,从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA,反转录合成c DNA,PCR扩增Em IMP1基因片段.其次,将Em IMP1基因扩增片段连接到原核表达载体p ET-28a构建表达质粒p ET-28a-Em IMP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达;将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内,每隔2周免疫一次,一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后,用所获得的多克隆抗体,对纯化后的Em IMP1进行免疫印迹试验鉴定,用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明,克隆出的Em IMP1基因的全长为1 140 bp,诱导出的蛋白大小为70 ku,且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示,用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性,酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价.因此,可通过原核表达蛋白Em IMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.

水稻蜡质基因OsCER4的原核表达及多克隆抗体制备

利用PCR方法扩增水稻(Oryza sativa L.)蜡质基因OsCER4的开放阅读框(Open reading frame,ORF),并克隆到原核表达载体pET-23d上,将表达载体OsCER4-pET转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株,以1.2 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,然后以融合蛋白作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体.SDS-PAGE电泳分析结果表明,成功诱导表达了分子量约为71.6 kD的融合蛋白,而Western blot检测表明,免疫家兔的抗血清与水稻幼苗总蛋白杂交信号较好.Os-CER4抗体的制备有助于研究OsCER4基因的表达特性.

幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18表达载体构建及其多克隆抗体的制备

目的制备幽门螺杆菌的外膜蛋白Omp18及其多克隆抗体。方法设计Omp18基因引物,PCR扩增Omp18基因,将其连入pMD-18T载体,再克隆入原核表达载体pTriEx(TM)-4,重组质粒转化大肠埃希菌JM109DE,IPTG诱导表达Omp18蛋白,纯化后免疫家兔,以获得多克隆抗体。结果 PCR扩增的Omp18基因成功克隆入原核表达载体,重组原核表达载体转化菌表达Omp18蛋白,纯化的Omp18蛋白免疫动物后血清中获得多克隆抗体。结论本实验成功进行了Omp18蛋白的原核细胞表达并制备了多克隆抗体,为研究Omp18的功能、表达调控以及幽门螺杆菌检测和疫苗生产等奠定了基础。

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的：构建HIV-1p15（Gag）原核表达载体，诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法：用PCR的方法扩增编码p15（Gag）基因序列，将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白，分别用His抗体和HIV阳性血清做westernblot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验（ELISA），细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果：原核表达载体pET28a（＋）-p15（Gag）成功构建，可在大肠杆菌BL2。（DE3）中用IPTG诱导表达，得到相对分子质量约20KD的p15（Gag）蛋白，经westernblot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔，制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论：得到纯化的HIV-1p15蛋白，制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15（Gag），为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。

Dhori病毒核蛋白基因的重组表达及其抗体制备

[目的]表达和纯化Dhori病毒(DHOV)核蛋白(NP),并制备多克隆抗体。[方法]RT-PCR扩增NP基因,并克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体peDNA3.1中。将重组质粒pET-28a-NP转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NP(rNP)的表达并亲和层析纯化rNP,以抗DHOV阳性羊血清检测其抗原性,免疫新西兰免制备抗血清,以ELISA法检测其效价。将pcDNA3.1-NP转染至Vero细胞,以间接免疫荧光法评估抗体的结合活性,WesternBlotting检测抗体与重组蛋白的特异性反应能力。[结果]pET-28a-NP和peDNA3.1-NP重组质粒构建正确,原核表达的rNP约为55.3kDa,并能被阳性羊血清识别,制备的抗体效价为1:409600,能特异性识别真核及原核表达产物。[结论]成功表达和纯化rNP,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究DHOV核蛋白的生物学特性及其检测试剂。