基于易错PCR技术的短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶基因BpL的定向进化

利用易错PCR技术对短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)YZ02脂肪酶基因BpL进行两轮定向进化研究,分别获得最佳突变株BpL1-7和BpL2-1369,其脂肪酶活力比出发酶分别提高了2倍和6倍。序列分析表明,突变体BpL2-1369有4个碱基发生了突变:T61C/C147T/A334G/T371A,其中有3个碱基突变导致了氨基酸的改变。通过SWISS-MODEL数据库模拟脂肪酶的结构显示,3个突变氨基酸分别位于第1个α螺旋的第3个氨基酸、第4和第5个β折叠之间的转角以及第5个β折叠的第1个氨基酸位置。将野生型脂肪酶基因BpL和进化后的基因BpL2-1369的高效表达产物经Ni-Agarose柱和Sephadex-G75纯化后,酶学性质测定表明:突变脂肪酶的比活力比野生型脂肪酶提高了1.31倍,Km值由8.24mmol/L降低至7.17mmol/L;在pH>8.0时的稳定性较野生型脂肪酶有所提高。

D-泛解酸内酯水解酶的定向进化

易错PCR结合DNA改组方法向D泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库进行筛选,最终获得一株酶活力高且在低pH条件下稳定性好的突变体MutE861。该突变体的酶活力是野生型酶的5.5倍。对突变体和野生型酶在pH6.0和pH5.0条件下的残余酶活进行对比,在这两种pH条件下,突变体酶的酶活残留分别为75%和50%,而野生型酶只能保持原来的40%和20%。通过软件对突变体MutE861酶基因和野生型酶基因进行分析对比,发现突变体MutE861酶基因发生了三处点突变,其中突变使两处氨基酸取代,另一处为沉默突变,未引起氨基酸的变化。

大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究

大肠杆菌碱性磷酸酶 (E .colialkalinephosphatase,EAP ,EC 3 1 3 1)是一个非特异性二聚体磷酸单酯酶 .采用易错聚合酶链反应 (errorpronePCR)的方法 ,在原有高活力突变株的基础上 ,对EAP远离活性中心催化三联体的区域进行定向进化 ,经两轮errorpronePCR ,获得催化活力较亲本D10 1S突变株提高 3倍、较野生型酶提高 35倍的进化酶 4 186 ,并对该酶的催化动力学特征进行了分析 .进化酶基因的DNA测序表明 4 186含两个有义氨基酸置换 :K16 7R和S374C ,二者既不位于底物结合位点 ,也不位于酶的金属离子结合位点 .

Error-prone PCR获得EPSP酶突变基因提高水稻的草甘膦抗性

将通过Error-prone PCR方法获得的表达水稻EPSP酶突变基因epsp102和未经修饰的水稻epsp基因分别导入籼稻恢复系明恢86,获得转化克隆84个和109个。对T1、T2代转基因水稻三叶期和分蘖期喷施草甘膦,各选出4个对草甘膦高抗性的T3代材料,进行分子鉴定。对其中的3个株系进行农艺性状考察,并各选1个株系作为父本与其他优良恢复系进行杂交,进一步考察epsp和epsp102基因在不同遗传背景下的抗性和农艺性状表现。Southern结果显示:epsp的整合拷贝数为2～3拷贝,epsp102拷贝数为1～2拷贝。萌发种子、三叶期及分蘖期对草甘膦抗性检测显示:转基因萌发种子对草甘膦的抗性提高15倍;三叶期对草甘膦的抗性提高3～4倍。分蘖期剂量效应检测结果显示:非转基因对照在施0.1倍以上的致死剂量农达时,植株显著失水,而转基因株系水分生理正常。两地两季的农艺性状考察显示:与对照相比转基因株系的穗数明显增多,转基因株系ep-3和ep102-20结实率和单株重与对照没有显著差异;以ep-3和ep102-20作父本,与4个恢复系杂交的F2代对草甘膦的抗性没有降低,两个组合的结实率显著增加,SK/ep-3组合结实率显著下降,其余组合的结实率与对照持平。

易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性

近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,构建了在大肠杆菌中的突变体库。通过刚果红平板筛选,获得了酶活性提高的突变株F-10,活力比亲本酶提高4.2倍。序列分析表明：F-10有5个碱基发生突变,两个氨基酸突变：D212V和T307S。SDSPAGE条带,表明基因表达正确,而表达量较原始菌株显著增加。酶学性质分析,表明该酶的最适反应pH为5.6,最适反应温度为45℃,在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持80%的剩余酶活,在60~75℃酶活力相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上,当温度高于75℃时,酶开始变性失活,酶活力迅速下降。研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。

易错PCR研究进展及应用

易错PCR是目前最简单、有效的一种基因体外随机诱变技术,是农业、工业、生物制药等领域获得优异基因的重要手段。本文综述了易错PCR的基本原理、方法、发展历程,以及该技术的最新研究成果、成功应用领域,并提出了目前存在的问题和可能解决途径。

通过随机突变提高抗TNF-α单链抗体的亲和力

目的:提高抗TNFα单链抗体(scFv)的亲和力。方法:应用错配PCR技术在抗TNFαscFv基因中引入随机突变,再通过DNA交换(shuffling)使引入的点突变进一步重排组合,构建突变噬菌体抗体库。采用硫氰酸盐洗脱法对抗体库进行淘筛。挑选活性得到改良的克隆,用斑点ELISA法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善。结果:对PCR错配的突变库筛选未得到亲和力明显改善的抗体变种,经DNA交换进一步构建变种库后,筛选获得1个亲和力提高的克隆,其相对亲和指数为1.37mol/L,较亲本抗体的相对亲和指数0.48mol/L有明显提高。结论:通过错配PCR和DNA交换引入随机突变构建抗体库,可有效地提高scFv的亲和力。

耐碱和耐热木聚糖酶研究进展

木聚糖酶是一种重要的工业用酶 ,近年来由于它在制浆和造纸工业中的特殊用途而受到广泛关注。在制浆和造纸工业中需要耐碱和耐热的木聚糖酶。要得到这样的木聚糖酶有两种办法 ,一是从极端环境中筛选这样的高产木聚糖酶的微生物 ,其二是用先进的生物技术对现有的木聚糖酶进行遗传改造 ,以达到耐热和耐碱的目的。

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化

以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的 5株CDR3突变体为基础 ,利用致错PCR和DNA重排方法对其进行了突变和重排 ,然后克隆重组装的突变单链抗体至载体pHB 1HSCFV而构建了库容为 10 5的抗体库 ,利用噬菌体表面呈现技术对构建的人源化抗体突变库进行了富集 ,并利用单链抗体 -碱性磷酸酶系统进行了阳性克隆的筛选和鉴定。随后以鉴定的 5株阳性克隆为基础进行了第二轮的致错PCR、DNA重排、抗体库的构建和富集 ,并筛选到 4株亲和力较亲本鼠抗体All更好的人源化抗体 ,该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制剂奠定基础。

酶的定向进化研究及其在工业生物催化中的应用

综合概括了各种蛋白质改造与微生物代谢途径改造的非理性定向进化技术的原理、特点,介绍了这些技术在高性能工业生物催化剂改造中的应用。

草苷膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构预测

利用错误倾向PCR(error-prone PCR)突变技术,以可变盐单胞菌(Halomonas variabilis)HTG7的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶基因为模板进行随机PCR扩增,得到目的基因片段(约1·35kb).将该基因片段与pACYC184载体连接后转化EPSP合酶缺陷型菌株大肠杆菌ER2799.利用功能互补筛选法得到了2株不具有草苷膦抗性的EPSP合酶阳性克隆突变株,记为Pmu1和Pmu2.序列分析表明,突变体Pum1的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有2处发生突变,导致氨基酸残基1处发生了改变;突变体Pmu2的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有5处发生突变,导致氨基酸残基2处发生了改变.对突变前后EPSP合酶进行比较预测发现,其三级结构及蛋白中心骨架是大致相同的,但突变前后氨基酸位点肽平面和Cα相连的N键之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明,酶的功能主要由蛋白的构象决定,二肽链形成后肽平面和N键之间角度的变化,造成高级结构构象细微的差别,致使草苷膦抗性功能丢失.

催化吲哚生成靛蓝的细胞色素P450BM-3定向进化研究

以催化吲哚产生的靛蓝在630nm处具有特殊的吸收峰为高通量筛选指标,将来源于Bacillusmegaterium的细胞色素P450BM-3单加氧酶的基因序列用易错聚合酶链式反应进行定向进化,通过多轮突变,在原有的能产靛蓝的高活力突变酶的基础上成功获得了三个高于亲本酶的突变酶,突变酶的酶活分别是亲本酶的6.6倍(hml001),9.6倍(hml002)和5.3倍(hml003),并对突变酶的动力学参数进行了分析.突变酶DNA测序的结果表明,hml001含有一个有义氨基酸置换I39V,hml002含有三个有义氨基酸置换D168N,A225V,K440N,hml003含有一个有义氨基酸置换E435D,这些突变位点有些远离底物结合部位,有些位于底物结合部位.

易错PCR定向进化大幅度提高极耐热β-葡聚糖酶的活性

采用易错PCR方法对来自于极耐热海栖热袍菌的内切葡聚糖酶Cel1B进行定向进化。携带有Cel12B基因的重组质粒pET-20b-Cel12B在固定Mn2+浓度下,通过使用不同浓度的Mg2+优化易错PCR条件,产物构建成pET-20b-Mu-Cel12B重组子,并建立突变体文库,重组子经改进的刚果红平板法筛选,通过透明圈的大小获得了酶活性大幅度提高的突变体3个,突变基因经诱导后的酶活力分别是在同样条件下诱导获得的亲本酶的2.1倍、3.2倍和3.7倍。

豆豉纤溶酶的定向进化

为提高豆豉纤溶酶的药用价值,通过易错PCR方法对来源于Bacillus subtilis DC-12的豆豉纤溶酶DFE基因进行突变并构建突变体文库,利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA对突变体文库进行筛选.通过3轮易错PCR最终获得催化效率提高的突变酶mDFE3.序列分析表明突变酶mDFE3基因发生了6处碱基突变,其中4处突变发生氨基酸取代,2处为同义突变;通过swiss-model repository模拟突变酶mDFE3的结构,显示3个突变氨基酸位于回环结构上,1个位于α螺旋上;酶动力学测定结果表明突变酶mDFE3的Km值由0.58mmol/L降低至0.45mmol/L,突变酶mDFE3的催化效率(kcat)是野生型的2.57倍.

黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA耐热突变体的筛选

为了改造黑曲霉(Aspergillus niger)来源的β-甘露聚糖酶ManA,获得耐热性高的突变体。利用易错聚合酶链式反应(PCR)技术对构建的表达质粒pGAPZαA-manA进行随机突变,将突变文库转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,表达筛选耐热性高的突变体,并进一步对突变位点进行定点突变,筛选其他耐热性高的突变体。结果表明,ManA的H283R与H283K突变体相对于野生型在耐热性方面有显著提升,75℃加热30 min其相对酶活由26.66%分别提升至76.95%和83.57%;在pH 3.0~9.0的条件下,50℃保存24 h,H283K突变体与野生型的相对酶活均在90%以上,H283R突变体在pH 3.0时的相对酶活下降到了84.72%,两个突变体的最适温度、pH及比酶活与野生型没有明显差异。说明β-甘露聚糖酶ManA的283位组氨酸(H283)对其耐热性较为关键,将该位点突变为精氨酸(R)和赖氨酸(K)时,ManA的耐热性得到显著提升。

Mn^(2+)驱动的不同长度DNA片段PCR随机突变研究

针对倾向错误的PCR技术中不同目的、不同长度基因的诱变种类一直缺乏准确参考的问题,以酵母spt15基因为研究对象,在标准的PCR反应体系中加入不同Mn2+摩尔浓度(0.125,0.250和0.500mmol.L-1)进行倾向错误的PCR,扩增spt15不同长度(分别约为200,500和700bp)的DNA片段,研究其突变频率,突变碱基数目及突变类型,以分析不同种类的突变所需的最佳条件.研究结果表明:长片段DNA的PCR突变率对Mn2+摩尔浓度更敏感;模板的长度对DNA PCR突变碱基个数也有较为明显的影响,低Mn2+摩尔浓度有利于单突变;Mn2+驱动的突变有明显的倾向性,其中A→G和T→C的突变居多.

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体随机突变与筛选

采用易错聚合酶链式反应技术,对来源于天然纳米抗体文库的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)纳米抗体进行随机突变,通过优化和比较突变条件,构建了突变分布均匀的突变文库。噬菌体展示技术对突变文库进行了6轮筛选,获得了8种突变序列,其检测信号为野生型2.1倍。多序列比对及三维结构建模分析表明,突变序列的突变位点集中于互补决定区与框架区连接的区域,并且部分序列出现了可以形成二硫键的氨基酸残基。研究结果为抗DON纳米抗体进一步的深度突变和改造提供了线索,同时可为其他抗小分子纳米抗体的改造提供借鉴。

基于易错PCR技术定向进化枯草芽孢杆菌β-葡聚糖酶

利用易错PCR技术对来自枯草芽孢杆菌的β-葡聚糖酶基因(bgls)进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,通过易错PCR技术得到突变基因产物,将其重组于表达载体pET32a(+),构建β-葡聚糖酶基因的突变体文库,通过刚果红平板染色法进行高通量筛选,最终获得两株突变酶,其最适作用温度比野生酶都提高了15℃,最适pH与野生酶基本相同,野生酶酶活力为84.2 U/mL,突变酶酶活力分别为247.3 U/mL和125.1 U/mL,是野生酶酶活的2.9倍和1.5倍。试验获得了具有耐高温高酶活的β-葡聚糖酶,为β-葡聚糖酶的工业化应用奠定基础。

酶的定向进化及其应用

综述了生物催化剂(酶)分子定向进化的产生、原理、方法及应用,深入阐述酶分子定向进化过程中的相关问题,重点介绍了易错PCR(Error-prone PCR)和DNA改组(DNA shuffling)等几种典型的酶定向进化方法与成功实例,展望了生物定向进化研究的发展前景。

Error-prone PCR致哈茨木霉几丁质酶突变的条件优化

运用Error-prone PCR对哈茨木霉几丁质酶基因(Chit42)进行人工突变。在常规PCR基础上,通过提高体系中Mg2+浓度,适当加入一定浓度Mn2+,调节四种dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dGTP)浓度,得到产生明显突变效果的试验条件。在Error-prone PCR中,使用5.0 mmol·L-1Mg2+,0.5 mmol·L-1Mn2+,0.04 mmol·L-1dATP和dGTP,1.5 mmol·L-1dTTP和dCTP进行扩增后,随机挑选10个克隆测序,累积13 370个碱基,检测到57个突变,平均突变率为0.4%。为产生优良突变株、酶分子定向进化奠定基础。