Proteomic mapping of secreted proteins of Trichoderma spp.

A series of highly taxonomically diverse Trichoderma strains were investigated using proteomic approaches, to investigate the utility of protein profiles as taxonomic markers and to identify proteins of potential economic importance. Initial studies have focused on a comparison of single strains of T. aureoviride, T. saturnisporum, T. polysporum, T. longbrachiatum and T. spirale, along with two strains of T. harzianum. All seven strains were grown in synthetic medium supplemented with 2%(w/v) glycerol, to maximize the diversity of extracellular protein production. Samples of secreted protein were separated by 2D gel electrophoresis and will be characterized by MALDI-TOF peptide fingerprinting.

MALDI-TOF-MS鉴定生物脱氮细菌的方法研究

采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对生物脱氮废水处理系统中分离得到的两株细菌进行蛋白质质量指纹图谱分析。对供试细菌,比较样品处理方法和基质选择对细菌蛋白质质量指纹图谱的影响,获得优化的实验条件,并对方法的重现性进行了研究。建立了一种快速的细菌蛋白质质量指纹图谱鉴定方法。结果显示:该方法灵敏度高,且分析过程简单快速,具有广泛的开发和应用意义。

基于LTQ-Orbitrap液相色谱-质谱联用技术的乳源乳清蛋白组分的差异性研究

利用LTQ Orbitrap XL组合型傅立叶变换高分辨质谱系统分析了乳源蛋白主要组分肽指纹图谱。对南方水牛乳与不同来源的乳清蛋白的氨基酸序列研究结果表明,乳清蛋白经酶解后主要为α-乳白蛋白(α-La)和β-乳球蛋白(β-Lg)组分,乳清蛋白肽质指纹谱的分析显示水牛乳与荷斯坦奶乳清蛋白α-La氨基酸发生变异的比率明显少于山羊奶乳清蛋白α-La,说明荷斯坦奶α-La和水牛乳α-La的差异更小,同源性更强;而水牛乳β-Lg与荷斯坦乳β-Lg氨基酸发生变异的部位比率要多于山羊奶,水牛乳β-Lg与山羊奶同源性更强;乳源酪蛋白酶解后的肽段主要组分为αs1-CN,β-CN,κ-N,通过对水牛乳酪蛋白的氨基酸序列的差异性分析,不同品种的乳源酪蛋白的氨基酸序列明显存在差异。与乳清蛋白相比,奶牛品种差异导致乳蛋白发生氨基酸差异现象更显著,酪蛋白的氨基酸序列对比表明,水牛奶酪蛋白与山羊奶酪蛋白比与乳牛酪蛋白的差异更大。

果梅完全花与不完全花的差异蛋白分析

应用双向电泳技术对果梅完全花与不完全花的蛋白质组分进行了比较分析。经专业分析软件(PDQuest)对电泳图谱分析表明两者的蛋白分布相似,在完全花中发现了1个特异蛋白、1个上调蛋白、21个下调蛋白,在不完全花中发现2个特异蛋白,这些蛋白差异点可能与雌蕊的败育有关。应用质谱技术对3个特异点及5个差异大的蛋白点进行分析,得到的肽段数据与蛋白质数据库比对发现其中一个蛋白(28.2kD,pI 4.53)与光敏色素B有关。

溶藻弧菌全菌可溶性蛋白二维图谱的建立及部分蛋白分子的鉴定

本研究采用蛋白质组学技术,建立了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03培养至稳定期的蛋白质组双向电泳图谱,并对部分蛋白分子进行了肽质量指纹图谱分析鉴定。首先将溶藻弧菌接种于TSB培养基28℃培养24 h,利用裂解液裂解细菌,提取全菌可溶性蛋白,荧光染料标记,24 cm pH4 ～ 7的胶条进行等电聚焦,再用12.5%的胶进行SDS-PAGE。2-D胶经过分析,得到902±8个蛋白斑点,重复胶的匹配点数为866±28,匹配率为96%。从双向电泳图谱中选取68个高丰度蛋白质点进行肽质量指纹图谱鉴定,其中60个在NMPDR数据库中得到鉴定,另外8个在NCBI数据库中得到鉴定。鉴定的蛋白中发现Serine protein kinase、purine nucleoside phosphorylase 和Alkyl hydroperoxide reductase subunit C-like protein存在修饰现象,它们在胶上均有2种表现形式。对68个蛋白进行了细胞功能的分类,发现能量代谢蛋白最多,占43%;其次是转运和结合蛋白,占9%;第三是外膜蛋白,占8%。经CMR操纵子预测软件分析预测到2个操纵子,它们均参与了能量代谢过程。研究结果为溶藻弧菌在不同生长条件下的比较蛋白质组学以及该菌强毒株和无毒株的比较研究提供了基础资料。

与浓缩苹果汁后混浊有关的蛋白质组成分析

从新鲜苹果和浓缩苹果汁中分离纯化蛋白质,用肽质量指纹谱对其进行鉴定,测定氨基酸组成和多酚及多糖的含量,结果表明,新鲜苹果蛋白的主要组分为Thaumatin-likeprotein1,是一糖蛋白,其疏水性氨基酸含量高,易引起苹果汁的后混浊。浓缩苹果汁中蛋白组分比较复杂,在贮存过程中与多酚及多糖发生结合,使分子量增大,其分子量均大于新鲜苹果蛋白。

基于质谱和生物信息学分析的小菜蛾蛋白质鉴定

本研究以非模式昆虫小菜蛾Plutella xylostella为材料,对比2,3,4龄幼虫的蛋白质组双向电泳图谱,得到24个蛋白质差异点,从中选取了编号为1111的差异表达蛋白质点进行质谱鉴定和生物信息学分析。采用胶内酶解的多肽进行MALDI-TOF/TOF分析,获得该点的肽质量指纹图谱(PMF)及串联质谱(MS/MS)图谱。将获得的PMF分别用MASCOT和ProFound等常用软件在NCBInr的Metazoa蛋白质数据库进行搜索,匹配结果不理想。进一步用PMF+MS/MS谱图搜索NCBInr的Metazoa蛋白质数据库,以及小菜蛾EST数据库。在NCBInr库中匹配结果为拟暗果蝇Drosophila pseudoobscura中的一种假定蛋白GA18218-PA,而用EST库搜索的结果为家蚕Bombyx mori的ATP合酶的亚基。为验证搜索结果,将该蛋白质点进行磺基异硫氰酸苯酯(SPITC)化学衍生后de novo测序,最后确认该点可能为ATP合酶的一个亚基。最后着重讨论了蛋白质的质谱鉴定与生物信息学分析的联合使用,希望据此选择出最适合于非模式昆虫蛋白质组学鉴定的方法。

血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探

目的探讨不同的标本处理和储存条件对蛋白指纹图谱技术检测血清多肽及低分子量蛋白质(1-30 ku)的影响。方法将血液凝固后马上分离得到的血清分装后分别置于-80℃6个月以上以及室温、4℃条件下2-72 h进行蛋白质质谱分析。结果血清样本在-80℃6个月以上以及4℃或者25℃保存2 h或者反复冻溶1次,对多肽及低分子量蛋白质的影响相对较小。将血清用U9缓冲液稀释后放置于室温,在24 h内结果稳定。溶血会对蛋白质组的结果造成很大影响。结论建议血液标本的处理、运送、操作及储存的蛋白质质谱分析的标准条件是:4℃下处理血液标本,2 h内尽快分离血清及细胞。用U9缓冲液稀释血清后,可以24 h内在室温下运送或对血清及WCX磁珠结合过程进行操作。血清应分装并长期储存在-80℃,但限冻溶1次。溶血标本应弃用,建议重新取血。

癌胚抗原阴性的结直肠癌检测和结直肠癌预后相关生物标记

目的探讨结直肠癌的发生、发展过程中患者血清质谱多肽蛋白图谱的变化,筛选与结直肠癌预后及癌胚抗原(CEA)阴性检测相关的肿瘤标记分子。方法用蛋白指纹图谱技术检测结直肠癌,结直肠管状腺瘤患者和健康者血清质谱多肽蛋白图谱。结果初步筛选出对结直肠癌有代表性的7个差异蛋白;2个与其淋巴结转移相关的差异蛋白;4个与其远处转移相关的差异蛋白;3个在其根治性切除后表达下降的差异蛋白;而由3398·3u、5477·1u和8453·9u组成的诊断模型对CEA阴性表达结直肠癌的阳性检测率为100%。结论蛋白指纹图谱技术可筛选出有意义的生物标记差异蛋白,这对结直肠癌预后判断、CEA阴性的结直肠癌检测和改变结直肠癌的进程具有重要意义。

亲和层析结合生物质谱技术分析鉴定猕猴血清中的重组人内皮抑制素

建立了将固相亲和层析与生物质谱技术相结合 ,分离提取鉴定给药猕猴血清中含有 6×His序列的重组人内皮抑制素的方法。用固相免疫亲和层析和金属螯合层析两种方法分别提取并富集血清中的重组药物 ,采用基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱的直接分析和肽质量指纹谱分析与数据库检索 ,分别对两种亲和提取方法得到的药物蛋白前体collagenXVIII[Homosapiens](IDofSWISS -PROT TrEMBL :Q8WXI5 )

苹果花芽孕育蛋白质组学初步分析

【目的】苹果为中国乃至世界最主要果树之一,但由于童期长、其育种工作一直落后于其它作物。本研究旨在揭示苹果花芽分化机理,缩短苹果童期,加速苹果育种进程。【方法】运用蛋白质组学研究技术(双向电泳技术、生物质谱技术、生物信息学技术)对富士苹果树短枝停长后3～9周的花芽、叶芽进行蛋白质分析研究。【结果】短枝停长后第7周花芽形态分化开始,第7周花芽较叶芽的2-DE图谱有283个蛋白点在表达上有明显的质和量的变化。4个蛋白点(16.4、30.2、40.3、65.1kD)为花芽形态分化开始时初前(花序原始体出现)花芽2-DE图谱所特有;3个蛋白点(39.3、60.2、66.3kD)为初后(侧花出现)花芽2-DE图谱所特有,1个蛋白点(77.1kD)为萼片期花芽2-DE图谱所特有。对富士苹果花芽形态分化开始时的4个特异蛋白点用基质辅助激光解吸P电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行肽质量指纹谱分析,并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测,初步认为第256号(16.4kD)、298号(30.2kD)蛋白点是未知蛋白,第327号(40.3kD)蛋白点是与合成酶有关的蛋白,第367号蛋白点(65.1kD)是一个与转录有关的RNA结合蛋白。【结论】富士苹果花芽形态分化开始时有16.4、30.2、40.3、65.1kD4个特异蛋白、侧花出现时有39.3、60.2、66.3kD3个特异蛋白、萼片出现时有77.1kD1个特异蛋白出现。16.4、30.2kD是未知蛋白,40.3kD是与合成酶有关的蛋白,65.1kD是一个与转录有关的RNA结合蛋白。

大鼠骨组织蛋白质组样品提取方法的建立

蛋白质组学是目前研究的重要热点.该文拟建立大鼠骨组织蛋白质样品提取的最佳方法,用于双向电泳分离,为进一步进行蛋白组学分析奠定基础.实验对3种不同方法制备的样本进行同一条件的二维电泳(2- DE)图谱,比较2- DE的结果.结果发现,丙酮沉淀法最佳.这些结果提示,只有结合骨组织成分特征与双向电泳的具体要求,选择恰当的样品提取液,采用合理的提取步骤,获得蛋白质样品,才能得到清晰高分辨率的电泳图谱,满足蛋白质组学分析需要.

家蚕精巢蛋白质的双向电泳及质谱分析

精巢是雄性家蚕Bombyxmori的生殖腺,它的主要功能是产生精子,全面检测和鉴定精巢器官的蛋白分布将为分析家蚕雄性个体的发育和繁殖奠定基础。本研究利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白硝酸银染色技术对家蚕5龄第5天幼虫的精巢组织进行了蛋白检测,利用基质辅助激光解析质量飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱鉴定。结果表明：家蚕精巢蛋白质可以检测出1000个以上的蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子量为15~90kD区域,等电点3.5~9之间,其中60个蛋白点得到了成功鉴定,按照已知或推测的蛋白功能,将其分为8类,包括：细胞骨架和细胞结构蛋白,膜蛋白或信号相关蛋白,大量应激反应蛋白（伴侣蛋白）,线粒体和能量产生相关蛋白,转录调控和翻译及DNA/RNA结合相关蛋白,酶和少量血液组成蛋白。其中很多蛋白可能在鞭毛形成、能量代谢及减数分裂过程中有重要作用。这些结果为进一步认识家蚕精子形成过程提供了重要的生物学信息。

基质辅助激光解析飞行时间质谱分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响

考察了基质辅助激光解析飞行时间质谱获得肽质量指纹谱(PMF)时主要分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响。将牛血清白蛋白(BSA)经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、酶解;肽段经质谱分析得PMF数据;用MS-Fit引擎在相同数据库及参数下搜索。得出:(1)激光脉冲击打次数在300次以前时,蛋白序列和肽段覆盖率逐步增加;当击打400次时,覆盖率呈下降趋势;(2)随着激光强度增加,目标蛋白得分、氨基酸序列和肽段的覆盖率逐步增加,但当强度增到1413时,则呈现降低趋势;(3)随延迟时间的增加,肽覆盖率呈递增趋势,但当达260ns后呈下降趋势。按照优化的分析条件对同一位点重复3次,重复性良好。通过对质谱数据准确度的考察,发现以Mix2为外标,数据跟标准值差异越小时,则经其校正后的肽段数据所搜索目标蛋白的得分越高、排序靠前、检出预选蛋白个数越少,可信度越高;反之,难获得候选蛋白。结果表明:质谱准确度和分析条件对蛋白质数据库搜索影响显著。

SELDI-TOF-MS技术筛选NSCLC血清肿瘤标志物

目的分析非小细胞肺癌(NSCLC)血清蛋白表达谱的改变,筛选并建立NSCLC血清蛋白的差异表达谱。方法应用表面增强激光解析电离化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS,简称SELDI-TOF或SELDI)技术,分析100例NSCLC患者和100例正常对照血清,获得蛋白表达图谱。用Biomarker Pattern(BPS)软件分析NSCLC差异蛋白并初步建立诊断模型。通过盲筛进一步验证诊断模型。结果发现NSCLC患者血清与正常人有16个显著差异的蛋白波峰,显著高表达8个(P<0.001)。显著低表达8个(P<0.001)。经BPS软件分析,建立分类树模型,其诊断的灵敏度为100%,特异度为100%。100例样本盲筛验证结果显示,其灵敏度为96.15%,特异度为95.83%。无吸烟史患者较有吸烟史患者血清中显著高表达蛋白质波峰有3个(P<0.05)。鳞癌患者较腺癌患者血清中显著高表达蛋白质波峰有2个(P<0.01)。不同病理分期患者之间未发现差异蛋白峰。结论SELDI-TOF-MS技术可筛选出NSCLC差异性蛋白并建立NSCLC诊断的分类树模型,有望成为NSCLC早期诊断的辅助指标。

肽质量指纹谱鉴定蛋白质时生物信息学分析条件的优化

为了优化肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint,PMF)鉴定蛋白质的生物信息学分析条件。将牛碳酸酐酶2(carbonic anhydrase-2,CAH2)和人热休克蛋白70s(Hsp70s)进行2-DE分离、酶解,肽段经过MALDI-TOFMS分析得到PMF数据。选择Swissprot、MSDB、NCBInr、Random等数据库和MASCOT与MS-Fit搜索引擎,以牛CAH2为模型优化搜索参数,结果表明:Swissprot是适合做蛋白PMF分析的数据库;主要参数最佳设置为:漏切位点数为1个,肽质量容错数为±1Da,同时肽质量类型选择平均分子质量比单同位素质量更便于候选蛋白的筛选。最后用人Hsp70s蛋白的PMF数据检验优化条件,结果表明,所选择的数据库及参数是可靠的。

表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱技术在急性重症胰腺炎预后相关蛋白质谱检测中的应用

目的应用蛋白芯片表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-Ms）技术检测急性重症胰腺炎不同预后相关蛋白质谱，探讨急性重症胰腺炎轻重程度及预后评估的新方法。方法用SELDI-TOF-MS方法检测浙江省人民医院2008年3月至2010年10月23例急性重症胰腺炎患者的蛋白质谱，按是否发生器官功能衰竭、胰腺脓肿、腹内压异常、死亡将全部患者分组进行蛋白指纹图谱比较。结果蛋白质峰谱特征显示，在1094U、2751U、5904U处并发胰腺脓肿（13例）的重症胰腺炎患者峰值（13．21±3．73，45．62±10．31，48．37±9．24）明显高于未并发胰腺脓肿组（70例）（4．33±1．79，8．87±3．21，4．45±1．59），差异有统计学意义，均P〈0．05。在635U并发器官功能衰竭组（11例）峰值（8．56±3．21）明显低于未并发器官功能衰竭组（12例）（37．82±12．65）；而在4103U、4187U处并发器官功能衰竭组（21．63±8．23，9．81±2．32）峰值则高于未并发器官功能衰竭组（3．32±1．29，1．14±0．49）。在4173U处并发腹内压增高组（10例）峰值（8．94±3．58）明显高于无腹内压增高组（13例）（1．97±0．73）；而在5635U处并发腹内压增高组峰值（0．62±0．23）则低于无腹内压增高组（15．78±6．34）。2例死亡患者蛋白指纹表现为血清蛋白全面合成功能减退，峰值降低。结论蛋白指纹图谱技术可筛选出有意义的生物标记蛋白，为急性重症胰腺炎并发症的早期诊断与治疗提供了新的路径，对急性重症胰腺炎预后评估具有重要意义。

应用蛋白质指纹图谱技术快速鉴别诊断菌阴肺结核

目的探索应用蛋白质指纹图谱技术于菌阴肺结核与肺炎的鉴别诊断。方法从本院临床病例中,选择菌阴肺结核和肺炎患者及健康者各60例,应用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI/ToF-Ms)和蛋白芯片技术检测血清蛋白,并应用Ciphergen蛋白芯片3.1.1软件进行比较,分析其相关蛋白峰值并进行统计学处理。结果对180例菌阴肺结核、肺炎患者、健康者的血清蛋白指纹图谱数据进行比较,发现有5个蛋白峰(1 028.49、4 796.56、7 564.77、8 048.02、11 526.75m/z)存在显著的差异,有统计学意义(P<0.01)。由这5个蛋白峰组成的诊断模型鉴别诊断菌阴肺结核与肺炎的总有效率84.2%(101/120),敏感性与特异性分别为82.5%(52/63),85.9%(49/57);阳性预测值86.7%(52/60),阴性预测值为81.7%(49/60)。诊断模型在判别肺炎、菌阴肺结核患者与健康者之间,总有效率达89.4%(161/180),特异性为100%(60/60),灵敏度为84.2%(101/120),阳性预测值100%(101/101),阴性预测值75.9%(60/79)。结论蛋白质指纹图谱技术具有方法简便、检测快速,标本用量少的优点,是筛选结核病特异性标志物的有效手段,通过蛋白质指纹图谱技术检测,发现了具有良好鉴别诊断的"诊断模型"。

质谱鉴定PC12细胞蛋白酶体抑制剂PSI-诱导性包含体中的LB蛋白质(英文)

路易(小)体(Lewy body,LB)构成特征的蛋白质组分在体外形成的路易(小)体样包含体(Lewy body-like inclusion)或聚集体(aggresome)中能够获得鉴定.通过蛋白质组学方法鉴定聚集体内蛋白质是一种新的途径.10μmol/L人工合成蛋白酶体抑制剂PSI(proteasomal inhibitor)作用PC12细胞48h,使其产生PSI诱导性包含体(PSI-induced inclusions).通过生物化学分级分离、双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-D)和肽质量指纹鉴定(identification via peptide mass fingerprints,PMF)的蛋白质组学方法,2个涉及突触递质合成的蛋白质、6个26S蛋白酶体亚基、2个细胞骨架蛋白、2个线粒体蛋白、1个抗氧化蛋白和7个分子伴侣蛋白和(或)分子伴侣样蛋白等20个LB蛋白质组分获得鉴定.结果提示,当PC12细胞发生蛋白酶体抑制时,这20个LB蛋白质组分可能被富集到PSI诱导性包含体中.

肺结核蛋白指纹图谱诊断技术研究

目的探索应用蛋白质组学技术于肺结核诊断。方法从本院临床肺结核病例中,选择痰检测结核分枝杆菌培养阳性、阴性肺结核患者共130名,以健康者65名为对照,进行血清蛋白指纹图谱检测,分析其相关蛋白峰值并进行统计学处理。结果 130例活动性肺结核患者,与65名正常人群血清蛋白质质谱数据的比较,5个蛋白峰(5335、8048、11683、11700、11526m/z)有差异,有统计学意义(P<0.01)。该诊断模型判别的总准确率为92.3%(180/195),特异度100%(65/65),灵敏度88.5%(115/130)。130例活动性肺结核患者中,菌(+)65例,质谱仪检测结果峰值为:5335m/z24例,11683m/z16例,8048m/z14例,11700m/z5例,占90.8%(59/65);菌(-)65例,峰值为:8048m/z20例,5335m/z14例,11526m/z8例,11683m/z7例,11700m/z6例,占84.6%(55/65)。结论血清蛋白质指纹图谱技术简便、快速,标本用量少,是筛选结核病特异性标志物的有效手段,有望成为活动性肺结核的早期辅助诊断指标。