人可溶性TALL-2突变体的原核表达及纯化

目的制备人可溶性(solubleTNFandapoptosisligand-relatedleukocyte-expressedligand2,sTALL-2)的3种突变体,为寻找sTALL-2的竞争抑性制剂创造条件。方法采用一步反向PCR,将编码sTALL-2第187位谷氨酰胺(Gln)的核苷酸序列分别置换为丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)的编码序列,测序正确后,亚克隆到原核表达载体pQE-80L;经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblotting鉴定表达产物,Ni2+-NTA柱层析纯化目和蛋白,进而经Sepha-dexG-75柱层析,获得同源三聚体分子。结果经一步反向PCR扩增后均得到441bp的DNA片段,测序分析表明分别为sTALL-2第187位谷氨酰胺残基置换为Ser、Asp、Arg的序列,3种突变体蛋白在大肠杆DH5α中获得成功表达,并得以有效纯化。结论成功制备了sTALL-2的3种突变体蛋白,为进一步探讨sTALL-2结构与功能的关系及寻找基于sTALL-2突变体的抗肿瘤分子奠定了基础。

小鼠CCL2蛋白原核表达及纯化分析

旨在构建小鼠CCL2原核表达载体并诱导表达纯化CCL2重组蛋白,初步检测CCL2蛋白对白血病细胞生物学功能的影响。通过PCR扩增小鼠CCL2基因,用LIC(ligation-independent cloning)法构建pGEX-4T-CCL2原核表达载体。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同温度及IPTG浓度下诱导表达,采用亲和层析法纯化表达产物,进行SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定,将纯化的重组蛋白处理C1498细胞检测其对白血病细胞黏附及迁移的影响。结果显示,成功构建了pGEX-4T-CCL2原核表达载体,通过优化表达条件,确定20℃、0.1 mmol/L IPTG诱导6 h能够表达目的蛋白。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化出了具有生物学功能的融合蛋白,且CCL2蛋白能够促进白血病细胞黏附及迁移,为CCL2在白血病功能及机制的深入研究奠定基础。