PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用。方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2+分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白。流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用。结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白。通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力。结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础。

融合蛋白PTD-SOD对紫外辐照下L-02细胞的保护和修复能力的研究

通过体外细胞培养,探讨了融合蛋白PTD-SOD是否径由跨膜转导而增强SOD对靶细胞紫外辐射损伤防护和修复能力。结果表明辐照时间为120s,酶活力为320U/mL时,PTD-SOD对细胞的保护率达58.5%,约为野生型SOD的5倍;紫外辐照时间为140s,酶活力为500U/mL时,PTD-SOD对细胞的保护率仍有43.2%,相同情况下野生型SOD的保护率趋近于0;辐照时间40s,酶活力为500U/mL时PTD-SOD对细胞的修复率有50.1%,而野生型SOD的修复率最高也没有超过8%。这些结果说明相对野生型SOD,PTD-SOD对L-02细胞的保护和修复能力得到了显著的增强,能有效地提高SOD的生物利用率。

TATPTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对白血病细胞系K562凋亡诱导作用

目的 研究基因重组 HIV- 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导域 (PTD)与 BCR/ ABL SH3结构域融合蛋白 (PTD-BCR/ ABL SH3)导入白血病细胞株 (K5 6 2 )的细胞后对 K5 6 2细胞增殖、凋亡的影响 .方法 通过台盼蓝拒染法、流式细胞术、透射电镜 (TEM)、激光共聚焦显微镜 (CL SM)及凋亡细胞原位标记 (TU NEL)等方法 ,测定了 PTD- BCR/ ABL SH3融合蛋白作用于 K5 6 2细胞后细胞的增殖、形态学变化、细胞凋亡和细胞周期参数的改变 .结果 ≥ 5μmol· L- 1 的 PTD-BCR/ ABL SH3融合蛋白对 K5 6 2细胞生长有抑制作用 ,浓度越高 ,抑制作用越强 ;苔盼蓝拒染法、细胞形态学、电镜超微结构、TUNEL原位杂交和 FCM检测的观察证明 ,PTD- BCR/ABL SH3融合蛋白可引起 K5 6 2细胞的凋亡和坏死 ;FCM检测显示该融合蛋白可将细胞阻滞在 G2 / M期 .结论 PTD-BCR/ ABL SH3融合蛋白进入 K5 6 2细胞后可引起细胞凋亡和坏死 ,导致细胞增殖抑制 .这一结果可能为慢性粒细胞性白血病 (CML )

PTD-GFP融合蛋白的纯化及其转导效率测定

为了纯化PTD-GFP融合蛋白,测定融合蛋白转导效率,研究融合蛋白在He La细胞中的转导效率与浓度的关系,试验诱导表达军事兽医研究所六室保存的含有p ET-20b-PTD-GFP重组质粒的BL21表达菌,超声破碎,取上清液通过多个层析介质得到高纯度融合蛋白,将纯化的蛋白加入到体外培养的He La细胞中,在荧光显微镜下观察PTD-GFP的转导情况,用InfiniteF500多功能酶标仪检测荧光强度,分析融合蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:纯化的重组蛋白纯度达到90%。原浓度蛋白和1/2原蛋白浓度24 h后转导效率都达到100%。通过统计学软件得到转导效率与PTD-GFP融合蛋白浓度之间的线性关系,回归系数为0.151 456,相关系数为0.954。说明融合蛋白纯度较高,其转导效率对蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着浓度增加转导效率增加。

重组蛋白PTD-HSP27的制备及其穿细胞膜和角膜组织的功能研究

目的:制备PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿过人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞膜及新西兰大白兔的角膜组织进入眼前房。方法:利用重叠延伸PCR法获得重组目的基因片段PTD-HSPB1-6His,构建重组质粒p KYB-PTD-HSP27-6His,原核诱导PTD-HSP27蛋白表达及纯化重组蛋白后对其进行Western blotting鉴定;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记重组蛋白PTD-HSP27并检测其穿透SRA01/04细胞膜的能力及兔眼角膜组织的能力。结果:成功构建并纯化制备目的蛋白PTD-HSP27,在PTD-HSP27孵育后的SRA01/04细胞及结膜囊滴注PTDHSP27兔眼前房内均可检测出重组蛋白PTD-HSP27。结论:通过重叠延伸PCR法及镍柱层析纯化法可以获得较纯的重组蛋白PTD-HSP27;重组蛋白PTD-HSP27能够穿透SRA01/04细胞膜及穿越兔眼角膜进入房水。

分泌型PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡

目的研究分泌型的含蛋白质转导结构域的凋亡素(PTD4-Apoptin)融合基因经人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达和分泌后,对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响,探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法构建PTD4-Apop-tin融合基因的pSecTag2分泌型真核表达载体,并采用脂质体介导将其转染入HUVEC细胞,Western blot检测PTD4-Apoptin融合蛋白的表达及分泌,转染48h后收集培养上清作为条件培养液,用于HepG2、L02细胞培养,共培养24h后,采用Western blot检测细胞内和核内Apoptin的含量,流式细胞术检测细胞凋亡。结果瞬时转染pSecTag2-PTD4-Apoptin的HUVEC细胞可表达及分泌PTD4-Apoptin融合蛋白,其培养上清中的PTD4-Apoptin融合蛋白可有效进入HepG2和L02细胞,并可在HepG2细胞核内聚积,显著诱导HepG2细胞凋亡达47.4%(P<0.001),而对L02细胞无此效应。结论 HUVEC细胞表达分泌的PTD4-Apoptin融合蛋白可显著诱导邻近HepG2细胞凋亡,而对L02正常肝细胞无损伤。

TAT PTD-Tachyplesin融合基因的重叠延伸PCR法合成

为探讨HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)对中国鲎抗菌肽tachyplesin的协同作用,试验以经毕赤酵母密码子优化后的tachyplesin成熟肽(54 aa)加TAT PTD(11 aa)的cDNA序列为参考模板,设计了6条单链寡核苷酸片段,首尾引物的5'端分别引入EcoR I和Xba I酶切位点,通过重叠延伸PCR方法成功合成了TAT PTD+Tachyplesin序列,序列全长219 bp,为其后续功能与协同作用研究奠定了基础。

大肠埃希菌表达的含PTD穿膜序列的融合蛋白3种复性方法比较

目的:探索融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP纯化以及复性的条件,以提高其复性效率,为后续融合蛋白生物学功能的研究做准备。方法:表达、提取并纯化包涵体形式的融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP,分别用稀释复性、透析复性、柱上复性的方法,对融合蛋白进行复性,分析不同方法的特点及包涵体复性率,采用流式细胞术检测融合蛋白的穿膜活性。结果:3种复性方法得到的融合蛋白复性率依次为:柱上复性得率最高,其次是透析复性,稀释复性得率最低。柱上复性后蛋白的穿膜效率最高,相对较低的是稀释复性,而未复性的融合蛋白穿膜效率极低。结论:3种复性方法均能对PTD穿膜蛋白复性,但以柱上复性最佳。

PTD-kallikrein对大鼠MCAO模型缺血再灌注损伤的保护作用

目的:观察PTD-kallikrein对大鼠MCAO模型缺血再灌注损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:以化学交联法构建PTD-kallikrein,鉴定PTD-kallikrein对血脑屏障的通透性,并测定PTD肽段对原代神经元、星形胶质细胞及PC12细胞的毒性作用,制备大鼠MCAO模型,梗死90min后再灌注,并分为生理盐水组、Kallikrein组、PTD-kallikrein组和PTD-kallikrein+B2抑制剂组。再灌注后24h,分别用NSS量表测定神经功能,TTC染色测定梗死灶体积,ELISA测定梗死灶细胞因子IL-1β、TNF-α及PGE2的含量。结果:PTD-kallikrein能通过血脑屏障,1μmol/LPTD肽段对上述3种细胞无毒性,10μmol/LPTD肽段对原代神经元和PC12细胞有轻度毒性;PTD-kallikrein能显著改善脑缺血导致的神经功能障碍、减小梗死体积、抑制细胞因子IL-1β、TNF-α及PGE2的释放,B2受体抑制剂能明显抑制PTD-kallikrein的神经保护作用。结论:PTD-kallikrein对大鼠MCAO模型缺血再灌注损伤有显著保护作用,并且很可能通过B2受体介导而发挥该功效。

高效hCu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能的研究

目的探讨h Cu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能。方法首先,人工设计合成蛋白转导域序列(protein transduction domain,PTD),以人胚肝组织的总RNA为模板,逆转录扩增得人铜锌超氧化物歧化酶全长c DNA序列。其次,将此序列及人工合成PTD序列定向插入p ET16b载体;测序鉴定后,将构建成功的重组载体导入E.coli BL21菌株,异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,经镍柱纯化,洗脱液经SDS-PAGE检测。最后,将纯化产物与食管癌细胞(EC9706)共孵育,用激光共聚焦和流式细胞仪的方法检测蛋白穿膜能力及活性。结果测序结果与人铜锌超氧化物歧化酶全长c DNA序列相符;SDS-PAGE结果出现18.6 kd和20 kd的目的条带;激光共聚焦和流式细胞仪的方法显示蛋白可穿膜且保持活性。结论本实验成功构建了PET16b/h Cu,Zn-SOD-PTD原核表达质粒,可在大肠杆菌中稳定表达融合蛋白,融合蛋白具有穿膜且保持活性。

PTD-ABD融合蛋白对髓系白血病细胞的增殖和凋亡的影响

目的研究癌基因BCR/ABL C末端肌动蛋白结合域(actin-binding domain,ABD)蛋白对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法构建含有ABD基因的重组表达载体,应用蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)将蛋白转入白血病细胞内,应用Western blot与免疫荧光法确定蛋白是否进入白血病细胞,然后分别应用流式细胞仪及MTT法检测融合蛋白对白血病细胞凋亡及增殖的影响。结果成功构建PTD-ABD融合表达载体,获得高纯度PTD-ABD融合蛋白。同时构建PTD表达载体并获得高纯度表达蛋白。将PTD、PTD-ABD蛋白与白血病细胞K562、HL60共培养,Western blot与免疫荧光法确定PTD、PTD-ABD蛋白成功进入细胞内。与阴性对照比较,PTD-ABD蛋白能显著抑制HL60细胞的生长,并且对HL60细胞的凋亡具有明显的促进作用,差异具有统计学意义(P<0.05),但对K562细胞的增殖及凋亡无影响(P>0.05);PTD蛋白对K562、HL60细胞的增殖及凋亡无影响,与阴性对照比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论PTD转导的ABD蛋白抑制HL60细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。

PTD-HBcAg融合蛋白诱导特异性CTL抑制转基因小鼠HBV复制

目的:探讨经PTD-HBcAg融合蛋白体内诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对HBV转基因小鼠病毒的抑制作用.方法:20只HBV转基因小鼠随机分组,融合蛋白PTD-HBcAg及对照蛋白HBcAg经皮下免疫小鼠,每周1次,共3次.流式细胞仪检测脾细胞中胞内细胞因子水平;微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平;荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HBVDNA水平;肝脏HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg表达.结果:PTD-HBcAg融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量,肝组织中炎性细胞的数量明显增多,同时对小鼠血清中HBsAg及HBVDNA水平有明显的抑制作用.肝组织HBsAg免疫组织化学蛋白平均吸光度分析显示,50μg和100μgPTD-HBcAg融合蛋白组中平均吸光度值与空白组和50μgHBcAg组相比明显降低(127.77±4.92,117.71±5.18vs156.84±4.94,138.70±5.92,均P<0.05),且组间比较差异有统计学意义.结论:PTD-HBcAg融合蛋白免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量,显著降低血清中HBsAg及HBVDNA水平,同时抑制肝脏中HBsAg的表达,在HBV免疫治疗中具有抗病毒作用.

PTD-BDNF融合基因克隆、表达和纯化

构建含蛋白转导结构域(PTD)与脑源性神经营养因子(BDNF)融合基因的质粒,并在大肠肝菌中表达。用PCR扩增PTD-BDNF融合基因,经DNA测序无误后插入表达质粒pJW2构建质粒pJPB,转化大肠杆菌并进行PTD-BDNF蛋白的诱导表达和纯化。结果DNA序列分析表明构建含有PTD-BDTF融合基因的质粒与设计相同,PTD-BDNF融合蛋白在大肠杆菌中获得表达并进一步纯化。

PTD-CHMP1A融合蛋白抑制肾细胞癌细胞的恶性生物学行为

目的:探讨蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)-染色质修饰蛋白1A(chromatin modifying protein 1A,CHMP1A)融合蛋白对肾细胞癌(renal cell carcenoma,RCC)细胞增殖、迁移、侵袭及体内移植瘤生长的影响。方法:分别用1、5、20μg/ml的PTD-CHMP1A(PTD-CHMP1A组)、5μg/ml的野生型CHMP1A(CHMP1A组)和PBS(PBS组)处理RCC细胞株A498和786-0。用MTT法检测PTD-CHMP1A对A498细胞增殖能力的影响,划痕愈合实验检测PTD-CHMP1A对A498细胞迁移能力的影响,用Transwell侵袭实验检测PTD-CHMP1A对A498和786-0细胞的侵袭能力的影响。将5×105个/ml的A498细胞注射于裸鼠体内,构建RCC移植瘤模型,观察20μg的PTD-CHMP1A对移植瘤生长的影响。结果:与CHMP1A和PBS组比较,1、5和20μg/ml的PTD-CHMP1A对A498细胞的增殖均出现不同程度的抑制作用,且呈明显的剂量和时间相关性;5μg/ml的PTDCHMP1A可有效抑制A498细胞的迁移(P<0.01)、A498和786-0细胞的侵袭能力(均P<0.05),且抑制A498细胞的侵袭能力呈剂量相关性。PTD-CHMP1A在体内可有效抑制裸鼠体内移植瘤的生长。结论:PTD-CHMP1A融合蛋白可以有效抑制RCC细胞的增殖、迁移、侵袭能力和体内移植瘤的生长。

低频超声辐射对融合蛋白PTD-SOD渗透离体皮肤的影响

通过小鼠的离体皮肤渗透,研究了低频超声(40 kHz)辐射对融合了蛋白转导域的超氧化物歧化酶(Protein transduction domain-superoxide dismutase,PTD-SOD)体外经皮渗透的影响。结果表明,透皮8 h时,低频超声与氮酮(Azone)的增渗比分别为3.40和2.52;低频超声作用下,药物初始pH=6.0时,接收池中的SOD活性最高,可达1598.00 U;药物浓度效应符合Fick扩散定律,且药物渗透系数为0.011。这些结果说明,低频超声能显著提高PTD-SOD的经皮渗透速率,且效果优于Azone;药物溶液的初始pH值及药物初始浓度均能影响PTD-SOD的透皮速率,其最佳pH值及最佳给药浓度分别为6.0和15.00 kU·mL-1。

带PTD的小鼠Foxp3 PRD缺失突变体对小鼠脾混合淋巴细胞反应的影响

目的:构建和表达带蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)的Foxp3(forkhead boxP3)PRD缺失突变体(PTD-ΔPRD)融合蛋白,并探讨其对脾混合淋巴细胞反应的影响。方法:应用PCR技术扩增获得小鼠ΔPRD片段核酸序列,将其分列插入到带PTD的pET28a-PTD和pET28a-PTD-eGFP原核表达载体中,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,利用镍柱获得并复性融合蛋白;Western印迹鉴定目的蛋白表达的正确性、流式细胞术和Western印迹检测融合蛋白穿膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力、双向混合淋巴细胞反应分析融合蛋白对T淋巴细胞增殖的影响。结果:融合蛋白可在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达,并获得了大量纯化的融合蛋白。流式细胞术和Western印迹显示融合蛋白穿越细胞膜进入EL-4细胞核中,混合淋巴反应初步证明融合蛋白具有抑制T淋巴细胞增殖的功能。结论:成功表达小鼠PTD-ΔPRD Foxp3融合蛋白,该融合蛋白能有效进入细胞核内,抑制T淋巴细胞增殖。

PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对肝癌细胞株SMMC-7721的杀伤作用

目的:探讨PTD鄄BCR/ABLSH3融合蛋白对肝癌细胞株SMMC鄄7721的体外杀伤活性。方法:通过将PTD鄄BCR/ABLSH3融合蛋白与SMMC鄄7721细胞共培养,用免疫细胞化学染色的方法观察和检测PTD鄄BCR/ABLSH3融合蛋白进入细胞后的定位,MTT法检测蛋白对肝癌细胞的杀伤活性,电镜观察SMMC鄄7721肝癌细胞与PTD鄄BCR/ABLSH3融合蛋白共培养后超微结构变化。结果:PTD鄄BCR/ABLSH3融合蛋白进入SMMC鄄7721细胞株后主要分布在细胞核,少量分布于胞浆。融合蛋白对SMMC鄄7721细胞株的杀伤作用呈浓度依赖性,在所选蛋白浓度和观察时限内,当蛋白浓度≥0.14mg/ml、共培养4h后,SMMC鄄7721细胞形态就出现改变,8h后出现死亡细胞。电镜显示,PTD鄄BCR/ABLSH3融合蛋白促使SMMC鄄7721细胞株凋亡。结论:PTD鄄BCR/ABLSH3融合蛋白能抑制SMMC鄄7721细胞株增殖,促进其凋亡,并改变其骨架结构。

PTD-Cry3Aa原核融合表达产物对甘薯小象甲的活性研究

为探讨TAT PTD对苏云金杆菌鞘翅目特效基因CryAa是否具有协同作用,本试验在实现了融合基因TAT PTD-Cry3Aa大肠杆菌原核表达的基础上,以甘薯小象甲为生测对象测定了原核表达产物PTD-Cry3Aa与Cry3Aa的毒力。结果表明,用大肠杆菌表达的Cry3A和PTD-Cry3Aa包涵体初提物均对甘薯小象甲成虫和幼虫有杀虫活性,且表现出一定毒力增效作用,对成虫的增效倍数为2.01倍,对幼虫的增效作用更加明显,达到3.19倍。这一研究结果对于甘薯小象甲的生物防治研究以及转基因抗虫甘薯的研究具有重要的指导作用。

PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定

目的:构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)、eGFP的小鼠Foxp3突变体(PTD-eGFP-△E250 mFoxp3)融合蛋白,为研究小鼠Foxp3的功能奠定基础。方法:利用重叠延伸PCR方法构建pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达此融合蛋白,经Ni2+柱纯化,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察其穿膜效率。结果:成功构建了pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并表达和纯化了PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示融合蛋白能很好地穿过细胞膜进入细胞内,并定位于细胞质和细胞核。结论:成功制备了具有穿膜活性的PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,为更好地研究小鼠Foxp3的功能与特性奠定了实验基础。

PTD-OD-HA融合蛋白对K562细胞中Bcr-Abl的抑制作用观察

目的探讨PTD-OD-HA融合蛋白转导K562细胞的动力学、定位及其与Bcr-Abl定位的关系,以及对Bcr-Abl寡聚化和Bcr-Abl酪氨酸激酶活性的影响。方法采用FITC标记PTD-OD-HA融合蛋白,观察蛋白转导K562细胞的效率与剂量和时间的关系,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在细胞内的定位,免疫共沉淀法检测融合蛋白与Bcr-Abl的相互作用,Western blotting检测Bcr-Abl的磷酸化水平。结果 PTD-OD-HA转导K562细胞呈剂量和时间依赖性。PTD-OD-HA定位于K562细胞胞质,与Bcr-Abl共定位,且能与Bcr-Abl蛋白相互作用,进而干扰Bcr-Abl同源寡聚化,并可降低Bcr-Abl的磷酸化水平。结论在K562细胞中,PTD-OD-HA融合蛋白能有效抑制Bcr-Abl同源寡聚化及磷酸化水平。