过表达HMGR催化结构域以优化酵母工程菌原人参二醇代谢途径的研究

目的过表达3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)催化结构域提高酵母工程菌中原人参二醇的产量。方法分别克隆酿酒酵母中编码3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶催化结构域的基因t HMG1、人参中达玛烯二醇-Ⅱ合酶基因ds和原人参二醇合酶基因cyp1、拟南芥中CYP450还原酶基因cyp-re,构建相应表达质粒,转化酿酒酵母INVSc1,并检测重组菌中原人参二醇产量。结果重组菌INVSc1-DS-GFP/CYP1/CYP-Re和INVSc1-DS-GFP/CYP1/CYP-Re/t HMG1中原人参二醇产量分别为3.04 mg·L-1和26.5 mg·L-1。结论导入基因t HMG1,使原人参二醇产量提高了8.7倍,该结果为优化酵母工程菌中人参皂苷代谢途径奠定了基础。

酸酐酯化法制备原人参二醇衍生物及其抗肿瘤活性

目的探究三七中原人参二醇的酸酐酯化反应,制备其衍生物。方法对原人参二醇3位-羟基基团进行结构改造,与酸酐试剂反应制备其衍生物,以期能够提高其抗肿瘤活性。所设计并合成的5个化合物1~5均未见文献报道,为新颖化合物。采用MTS法探究其衍生物抗肿瘤活性,以顺铂和紫杉醇为阳性对照药,筛选化合物1~5对体外抗肿瘤细胞株人白血病细胞株(HL-60)、肝癌细胞株(SMMC-7721)、肺癌细胞株(A-549)、乳腺癌细胞株(MCF-7)、结肠癌细胞株(SW480)的生物活性。结果化合物5对HL-60细胞、SMMC-7721细胞和A-549细胞都有抑制作用。结论酸酐酯化法操作简单,反应容易控制,对于三七中的原人参二醇的结构改造和抗肿瘤活性研究具有参考价值。

三七皂苷的人肠道菌群体外代谢研究

研究三七中皂苷类成分(原人参二醇PPD型和原人参三醇PPT型)的人离体肠道菌群的厌氧代谢,为三七皂苷类成分代谢特征的研究提供参考。采集健康成人的新鲜粪便制备肠道菌群混悬液,分别与每种三七皂苷进行体外厌氧培养,HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS方法对代谢产物进行定性和定量分析。结果:(1)三七中皂苷类成分的代谢途径包括PPD和PPT型,PPD型代谢途径为人参皂苷Rb1→人参皂苷Rd→人参皂苷Rg3→人参皂苷Rh2→PPD和人参皂苷Rb1→七叶胆苷XVII→人参皂苷F2→人参皂苷Compound K→PPD,PPT型代谢途径为人参皂苷Re→人参皂苷Rg2→人参皂苷F1→PPT和三七皂苷R1→三七皂苷R2→人参皂苷Rh1→PPT以及人参皂苷Rg1→人参皂苷Rh1→PPT。(2)三七皂苷的人肠道菌群代谢反应主要是脱糖反应,即在相同母核结构下,四糖苷、三糖苷、二糖苷、单糖苷逐步转化为苷元,其中单糖苷和苷元在肠道菌群环境中的含量较多且相对稳定。(3)由于三七皂苷上的糖基位置的差异,PPD的代谢程度要高于PPT。结论:三七中的皂苷类成分可被人肠道菌群代谢,皂苷成分的代谢造成比例发生变化,单糖苷和苷元的含量较多且相对稳定,揭示了单糖苷和苷元可能是三七在体内发挥药效的物质基础。

人参总皂苷亲和"垂钓"脑内蛋白质靶点的研究

目的:预测人参总皂苷在脑内的蛋白质作用靶点。方法:采用直接亲和法亲和"垂钓"出脑内可能与人参总皂苷相互作用的蛋白质;然后采用SDS-PAGE凝胶电泳对"垂钓"出的蛋白质进行分离、染色、挖取蛋白质斑点胶块,并采用MALDI-TOF/TOF串联二级质谱对未知蛋白质进行鉴定;采用生物膜层干涉技术(BLI)测定人参皂苷和疑似蛋白14-3-3之间的相互作用,来进一步确认疑似蛋白14-3-3是否与人参皂苷有直接的分子间相互作用,以及哪种人参皂苷单体与14-3-3蛋白的亲和力最强。结果:亲和"垂钓"和质谱共鉴定获得5个预测蛋白,分别为:14-3-3蛋白、肌动蛋白、肌酸激酶B型、ATP合成酶、未知蛋白质;动力学分析显示14-3-3蛋白与原人参二醇、原人参三醇存在分子间相互作用,并且KD值分别为7.8×10-4和5.62×10-4。结论:14-3-3蛋白是人参总皂苷脑内的作用靶点之一,人参皂苷体内代谢产物原人参二醇、原人参三醇可能是14-3-3蛋白的激活剂。

原人参二醇纳米混悬剂的大鼠在体肠吸收研究

目的考察原人参二醇纳米混悬剂的在体肠吸收特征。方法采用溶剂蒸发法,以白蛋白作为稳定剂制备原人参二醇纳米混悬剂。以酚红为标示物,采用大鼠在体单向肠灌流法评价原人参二醇纳米混悬剂的大鼠在体肠吸收特性。结果Zetasizer nano ZS仪测得原人参二醇纳米混悬剂平均粒径为(220±10)nm,Zeta电位为(-28±0.2)m V。肠吸收实验表明,原人参二醇纳米混悬剂在整个肠段都有吸收,且吸收速率常数(Ka)与渗透系数(Peff)均大于原人参二醇原药(P<0.05),原人参二醇纳米混悬剂在小肠段(十二指肠、空肠和回肠)的Ka与Peff均大于结肠(P<0.05)。结论原人参二醇纳米混悬剂能够有效促进原人参二醇的大鼠在体肠吸收,其转运机制可能为主动转运或促进扩散。

超高效液相色谱法同时测定三七的叶和花中3个皂苷类成分含量

目的:建立超高效液相色谱法测定三七的叶和花中人参皂苷Rb_1、Rb_2和Rb_3的含量。方法:采用Waters ACQUITY BEH C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm),以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,流速0.4 m L·min^(-1),柱温30℃,检测波长203 nm。结果:人参皂苷Rb_1、Rb_2和Rb_3线性关系良好;三七叶中上述3个成分平均加样回收率(n=9)均为100.5%,三七花中上述3个成分平均加样回收率(n=9)分别为99.3%、99.7%、98.6%。12批三七叶样品中人参皂苷Rb_1、Rb_2和Rb_3含量范围分别为0.35%~0.59%、0.16%~0.68%、0.73%~3.33%,11批三七花样品中上述3个成分含量范围分别为0.46%~2.91%、0.83%~2.36%、2.95%~8.37%。结论:建立的方法可用于三七叶和三七花的含量测定。

抗肿瘤有效成分20(R)-25-OCH_3-原人参二醇的结晶法分离

目的从25-OCH3-原人参二醇(25-OCH3-PPD)非消旋体混合物中分离得到抗肿瘤有效成分20(R)-25-OCH3-PPD(AD-1)。方法采用结晶法拆分25-OCH3-PPD非消旋体混合物中的AD-1,并对所用溶剂的种类、用量及结晶温度等分离条件进行了优化,探讨溶剂的介电常数和25-OCH3-PPD非消旋体混合物的S/R比例间的关系。结果 25-OCH3-PPD非消旋体混合物(R:59.34%;S:38.35%),在最优条件下,丙酮26 mL、4℃时,可以获得AD-1的产率与纯度分别为38.76%、97.83%。结论溶剂的电解质范围在20.7左右,低饱和度的溶剂以及低温有利于AD-1的分离。