平菇与香菇属间原生质体融合的研究

通过分离和出菇试验,获得了纯化的平菇(Pleurotus sapidus)和香菇(Lentinus edodes)单孢系。用溶壁酶去细胞壁制备成原生质体。以PEG为融合诱导剂,诱导两者原生质体融合。1988年获得了可以出菇的融合子。这些融合子形成的子实体,从形态、生长习性和菌伞的颜色特征上都与双亲有明显的差异。大部分氨基酸含量介于双亲之间。同功酶分析也显示出融合子呈现与双亲不同的酶带。融合子出现的上述新性状,可能是平菇与香菇的原生质体基因重组的结果。

通过灭活原生质体融合选育啤酒酵母新菌株

将生产用啤酒酵母（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＬＱ１６ 和ＱＳＢ７ 分别进行单倍体化，并筛选ＬＱ１６（Ｉｌｅ － ，Ｄａｔｒ） 和ＱＳＢ７（Ａｌａ－ ，Ｈ２Ｓ－ ） 的遗传标记。经摇振培养后，酶解制备原生质体，对前者进行紫外灭活，而后者进行热灭活，再利用ＰＥＧ 进行融合，在ＭＭＲ 和ＳＭＭＲ 培养基上再生，挑选融合子。连续传代稳定后鉴定融合子ＱＳＢＸＩ６ 。通过细胞体积和生物量的测定，以及遗传型的分析和细胞ＤＮＡ 含量测定等均证实了获得的是融合子。经对啤酒感观评价，双乙酰含量测定与多种成分的气相色谱分析以及啤酒的发酵度，絮凝性、稳定性测定，并经连续多次生产试验证实ＱＳＢＸＩ６ 是一株口味独特、发酵度高、絮凝性强、遗传性能稳定兼具有多种优良性状的啤酒酵母生产新菌株。

高效絮凝菌的细胞融合及产絮特性研究

从含油废水处理曝气池活性污泥中分离到具有絮凝特性的絮凝菌株F2、F6,絮凝率在80%以上.对絮凝菌F2、F6的絮凝基因进行基因定位.首先对菌株F2、F6进行药物抗性遗传标记选择,然后提取质粒,其中F6无质粒,则絮凝基因在染色体上;F2有质粒,将具有絮凝特性的菌株F2的质粒转化到无絮凝特性的受体菌DH5α细胞中,最后对转化菌进行絮凝特性检测.结果表明,转化菌株的絮凝效果明显低于原始亲株F2.初步判断F2、F6絮凝基因定位于染色体DNA上,不在质粒上.因此,为了提高絮凝菌的絮凝效果,利用高效产絮菌株F2、F6作为亲本菌株,进行原生质体融合,对融合条件进行优化,并对融合子进行絮凝测定.实验结果确定了青霉素GK的最适浓度,F2为0.6U·mL-1、F6为0.1U·mL-1,得到了相应的原生质体及融合子;经絮凝试验对融合子的验证,结果表明,数株融合子表现出产絮特性,融合子絮凝效果与亲本菌株F2、F6相当.

酿酒酵母与雨生红球藻的细胞融合子的RAPD鉴定

用7条随机引物对雨生红球藻(Haemotococcumpluvies)、酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)及其融合酵母变株进行RAPD分析.在融合子的54条谱带中,有7条为双亲共有,占12.96%,与酿酒酵母相同的18条(33%),与雨生红球藻相同的17条(30.9%),其余12条(23.54%)为融合子的新谱带,结果表明该融合子很可能是雨生红球藻、酿酒酵母细胞杂种.

遗传工程菌Fhhh降解精对苯二甲酸与mnp基因表达

跨界融合构建的遗传工程菌Fhhh及其亲株黄孢显毛平革菌 (PC) ,降解精对苯二甲酸的比降解率受到Mn2 + 、酒石酸铵、H2 O2 、pH共 4因素的影响 .除pH值外 ,其余 3个因素影响 2菌株比降解率大小的排序完全一致 .pH值对PC菌的影响排序处于第 3位 ,对Fhhh则处于第 1位 .Fhhh比降解率比PC高出 11 11% ;mnp基因表达的锰过氧化物酶 (MnP)比活力水平比PC高出 15 2 2 % .降解精对苯二甲酸 4因素优化水平 ,也是mnp基因表达的优化条件 .比降解率与MnP的比活力水平之间有显著或极显著正相关性 (r>r0 .0 5( 4) ,r >r0 .0 1( 4) ) .

双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合子筛选方法的探讨

目的:探讨双歧杆菌(Bifidobacterium)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)原生质体融合子的筛选方法。方法:将双歧杆菌和酿酒酵母原生质体进行原生质体融合,采用10%乳糖中性红培养基进行融合子的初筛,并分析融合子传代稳定性、生物学特性,采用双歧杆菌属特异性寡核苷酸探针对亲本菌和融合子进行了荧光原位杂交检测比较。结果:结果表明,筛选得到的融合子具有双歧杆菌的特异性序列和亲本菌的生物学特性。结论:双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合,实现了厌氧菌和酵母的跨界融合,为双歧杆菌生物学功能的开发提供新思路、新途径。

啤酒酵母原生质体融合株HN31-6的啤酒酿造中试研究

为了考察啤酒酵母融合株HN31-6的啤酒酿造生产性能,以12.5°Bx麦芽汁为培养基,用500 L发酵罐在12℃下发酵,发酵期间每天取样测定发酵液的发酵度和酒精度以及发酵液的双乙酰、乙醛、高级醇和酯类等挥发性物质的含量.结果表明:在上述条件下,发酵14 d,发酵液的发酵度和酒精度分别为69.9%和4.46%;双乙酰和乙醛的含量分别为0.036 4 mg/L和4.53 mg/L;异戊醇、异丁醇和正丙醇的含量分别为46.47、8.34和9.82 mg/L,总高级醇的含量为64.6mg/L;甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯的含量分别为0.132、21.92、0.037、2.22和0.293 mg/L,总酯为24.6 mg/L;该菌株的发酵度以及发酵液的酒精、双乙酰、乙醛、总高级醇和一些酯类等的含量均达到国家优质啤酒的标准,啤酒口感良好.该融合株在啤酒酿造生产中具有很好的应用前景.

芽孢杆菌和欧文氏菌的原生质体融合的研究

采用原生质体融合技术对带有链霉素标记的芽孢杆菌B12 13 2 和带有红霉素标记的欧文氏菌E2 6 2 3 进行原生质体融合。采用选择性及非选择性培养基对融合子进行 10次重复性传代试验后 ,获得稳定的融合子 2 84株 ,经重复性苎麻脱胶试验 ,从中获得 6株脱胶效果较好的融合子。

利用DOT-ELISA筛选酵母融合子

利用动物免疫方法制备了啤酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)和毕赤氏酵母 (Pichiapas toris)的免疫血清。将啤酒酵母和毕赤氏酵母单倍体化 ,通过原生质体融合技术促使其融合。融合后将再生菌落影印到硝酸纤维膜上分别和双亲免疫血清做Dot ELISA反应 ,呈现双阳性的即为双亲融合子。

酵母属间融合构建直接转化淀粉生产燃料酒精的新型菌株

以糖化酵母和酿酒酵母为亲本,采用单亲灭活原生质体融合技术进行属间融合,同时对酵母原生质体形成和再生条件进行了探索,取培养6h￣8h的单倍体在30℃下,2.0%的蜗牛酶酶解1.0h时,其形成率超过92%。并对双亲与融合子的细胞大小、DNA含量、淀粉利用率及产酒精能力等进行了比较研究;获得1株融合子,利用可溶性淀粉发酵,酒度可达6.5%(v/v)。

灵芝原生质体制备与融合条件的研究

以美国大灵芝和信州灵芝为起始菌株,对其原生质体制备和融合条件进行研究。结果表明:美国大灵芝原生质体制备最佳条件:摇瓶培养4d的菌丝球,复合酶液酶解,温度31℃,时间3h,原生质体制备率为5.80×106个/mL,再生率为0.32‰;信州灵芝原生质体制备最佳条件:摇瓶培养5d的菌丝球,复合酶液酶解,温度31℃,时间2.5h,原生质体制备率为4.71×106个/mL,再生率为0.24‰。两种原生质体最佳融合条件:促融剂PEG浓度30%,Ca2+浓度0.03mol/L,时间30min,温度35℃,融合率0.47%。

絮凝菌的细胞融合研究

从活性污泥中分离到具有絮凝特性的絮凝菌株F2和F6,絮凝率在80%以上。为了提高絮凝菌的絮凝效果,利用F2和F6作为亲本菌株,进行原生质体融合。首先对菌株F2和F6进行药物抗性遗传标记选择,然后分别对融合条件进行优化,并对融合子进行絮凝测定。实验结果确定了F2具有氨苄青霉素抗性,F6具有新霉素抗性,青霉素敏感试验中,最适浓度分别为F2为0.6 U/mL、F6为0.1 U/mL,得到了相应的原生质体及融合子;经絮凝试验验证,数株融合子表现出产絮特性,但絮凝效果与亲本菌株F2和F6相当。

平菇种内原生质体分离与融合杂交育种技术及应用

将PDY液体培养的16个平菇资源品种的菌丝体,在25℃、pH5.8～6.0环境下,分别用1.5%溶菌酶+0.6mol/LKCl稳渗剂溶解其细胞壁2h,原生质体数得量最高;将获得的原生质体两两配对成39个组合,在30℃、pH9.0、0.6mol/LKCl稳渗剂、不加融合促进剂CaCl2和PEG6000的融合条件下,得到种内杂交融合子5株。其中有4株融合子再生出菌丝体和子实体;同皿接种实验显示,新菌株与其双亲具明显的拮抗性。经栽培试验与生产示范,新育的"优生1号"品系表现适应性强,优质、丰产、抗杂、耐热。

香菇原生质体融合菌株培养条件的优化

对融合子F2的培养条件进行了正交试验 ,着重对温度、培养基 pH、碳源种类和氮源浓度进行了优化。结果表明 ,35℃、pH6.0、可溶性淀粉、2 %(NH4 ) 2 SO4 为其最适培养条件。其最适 pH与两个亲本的基本相近 ,其最适生长温度接近虎皮 - 0 1亲本的生长温度 。

香菇原生质体融合及融合子的鉴定

以香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｓｅｄｏｄｅｓ）种内不同株一对亲和的单核菌丝（７４０２〈２〉和９１０１〈１２〉）为亲本，以碘乙酰胺失活７４０２〈２〉作为筛选标记，经过原生质体制备、ＰＥＧ融合及融合子再生等步骤，选育得融合子。融合子与双亲无拮抗性，在菌丝形态，核数目及可溶性蛋白质图谱、酯酶同工酶谱和过氧化物酶谱上均与双亲单核菌丝及担孢子杂交子有区别。将Ｋｎｏｗｌｔｏｎ等于１９８４年建立的一种分离高频再生衍生株的方法首次运用至食用菌中，使原生质体再生率提高２－３倍，为融合操作提供了方便。

番茄灰霉病生防融合子基因组DNA提取方法的研究

以番茄灰霉病生防菌株木霉T-23和链霉菌A的融合子为实验材料,在SDS-CrAB法、改进CTAB法和氯化苄法的基础上加以改进,比较和研究了真菌融合子基因组DNA的提取,找到了一种快速、高效的基因组DNA提取方法,为进一步对融合子进行生防机制和分子生物学水平的研究提供基础。结果表明SDS-CTAB法提取的基因组DNA OD_(260)/OD_(280)为1．909,DNA浓度约为42．0ng/μL,可以满足分子生物学实验的需要。并将提取的基因组DNA直接用于PCR扩增,得到了多态性的RAPD图谱。

平菇种内原生质体分离与融合杂交育种技术的研究

将16个平菇资源品种的菌丝体,在25℃、pH5.8～6.0环境下,分别用1.5%溶菌酶加0.6mol/LKCl稳渗剂溶解其细胞壁2h,原生质体数得量最高。将获得的原生质体两两配对成39个组合,在30℃、pH9、0.6mol/LKCl稳渗剂、不加融合促进剂CaCl2和PEG6000的融合条件下,得到种内杂交融合子5株。其中4株融合子再生出菌丝体和子实体;同皿接种实验显示,新菌株与其双亲具明显的拮抗线。经栽培试验与生产示范,新育的“优生1号”品系表现适应性强,优质、丰产、抗杂、耐热。

用原生质体融合技术选育2－酮基－L－古龙酸高产菌株的研究

对革兰氏阳性的地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｈ１９和革兰氏阴性的２－酮基－Ｌ－古龙酸产生菌Ｓ１９的原生质体的制备条件进行了研究，并采用聚乙二醇作诱导剂进行了两菌株的原生质体融合，用链霉素作为抗性标记对融合子进行了选择。从１７株产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的融合子中选出了一株连续传代八次产酸高且产量稳定的融合子１５号。融合子１５号具有两个亲本菌株所具有的一些特性。

侧耳属种间原生质体融合杂种选育的研究

用^(60)Co-γ射线辐射诱变佛罗里达侧耳孢子,得到抗NaN_3药物的突变体。突变体的原生质体经0.83%碘乙酰胺灭活处理,与姬菇单核菌丝释放的原生质体进行融合,然后涂布在1×10^(-6)NaN_3药物选择再生培养基上,得到一个融合子菌落。经酯酶同工酶分析表明:融合子的12条区带中,与双亲共有的区带5条,与佛罗里达侧耳亲本同者2条,与姬菇亲本同者3条,新菌株独具的区带2条,证实为双亲融合杂种。

重寄生链霉菌F46与链霉菌SC1融合子的筛选

运用原生质体融合技术将重寄生链霉菌F46与生防链霉菌SC1融合,获得40株融合子。依据形态特征、皿内拈抗试验对获得的融合子进行初筛,发酵液抑菌活性测定,筛选出2株抑制效果明显的融合子FSf-11 和FSf-13。皿内拮抗试验结果表明,2个融合子对灰葡萄孢(B．cinerea)有明显的抑制作用,抑制率比亲本SC1 分别提高了27．99％和20．56％,镜检发现灰葡萄孢的基内菌丝畸形,经FSf-13处理后还出现原生质凝聚现象。融合于的发酵滤液对胶孢炭疽菌(C．gloeosporioides)抑制效果显著,抑菌圈直径超过了20 mm;融合子 FSf-11的发酵滤液对尖镰孢萎蔫专化型(F．oxysporum f．sp．vasinfectum)和大丽轮枝菌(V．dahliae)的孢子萌发抑制作用最强,其孢子萌发率低于10％;融合子FSf-13对2种靶标菌的孢子萌发抑制率也超过了50％。