巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合育种

为了培育出生长速度快、生长周期短的巨大口蘑优良新菌株,以巨大口蘑和双孢蘑菇2796为亲本菌株,建立原生质体聚乙二醇(PEG)融合体系。将分别经过紫外灭活的巨大口蘑和热灭活的双孢蘑菇原生质体按照体积比1∶1混合,PEG(分子量6000)质量分数为30%,Tris浓度为0.016 mol·L-1,Ca2+浓度为0.014 mol·L-1,30℃水浴20 min,该最佳融合条件下融合率达0.0387%。利用灭活原生质体作为标记筛选出融合子,再生培养后通过菌落形态、细胞学观察、拮抗试验、出菇试验验证再生菌株为融合菌株,最终从7个再生菌株中筛选出3个融合菌株,进行出菇试验。试验表明,3个融合菌株的母种和栽培种生长速度明显快于母本菌株巨大口蘑,栽培周期明显缩短。

一株橘绿木霉TR673原生质体的制备、再生及融合研究

从齐齐哈尔市大豆根围土壤中分离得到1株木霉菌株TR673,经分子生物学及形态学鉴定,确定其为橘绿木霉(Trichoderma citrinoviride)。采用崩溃酶对TR673的菌丝体进行裂解制备原生质体,分别采用50℃水浴5 min和紫外线照射(20 W、40 cm)90 s对原生质体进行灭活,再将灭活的原生质体用聚乙二醇融合法进行融合,并对TR673原生质体的制备和再生条件进行了优化。结果表明,用20 g·L^(-1)的崩溃酶对培养16 h的TR673菌丝体酶解(裂解)5 h时,原生质体产量最大,达到1.2×10^(6)个·mL^(-1)。用ZS1培养基对原生质体进行再生培养,其再生率可达12.3%。融合菌株TR673-3的哌珀霉素产量达1282.67 mg·L^(-1),较原始菌株TR673的哌珀霉素产量提高了18.11%。本研究为后续的橘绿木霉基因组的编辑、转化以及其它木霉菌原生质体的制备、再生与融合等实验提供了参考依据。

利用原生质体融合技术选育微生物菌种

对原生质体融合技术的遗传标记筛选、原生质体的制备与再生、原生质体融合等的方法 ,以及原生质体融合技术在提高抗生素生产效价、酵母菌工程菌株的构建、多功能菌株的选育以及污水处理工程菌的构建等方面的研究情况进行了综述。就原生质体融合技术在微生物育种技术上的应用前景进行了分析。

原生质体融合技术选育高效菌株降解聚乙烯醇

从自然界中分离聚乙烯醇(PVA)的降解细菌,经紫外线诱变,得到两株具有单重抗药性的突变菌株S7(Strs,Kanr)和 K15(Strr,Kans),两者对 PVA的去除率分别达到 52%和 58%.将 S7和K15作为亲本菌株进行原生质体融合,并对融合条件进行优化,融合子 F4 菌株对 PVA去除率达到79.9%,将其培养成活性污泥后,PVA去除率可达87%,是普通活性污泥的三四倍.

灵芝原生质体融合HH系列菌株的选育研究

以灵芝菌株韩芝和红芝为亲本,进行原生质体融合,获得125株再生菌株,其中有锁状联合的菌株103株。与亲本的拮抗结果显示,在与双亲均有拮抗的20株中,10株能正常形成子实体,但菌株间性状差异显著,其中HH55、HH58和HH87具有突出的农艺性状,具有进一步开发应用的价值。

表达两种不同外膜蛋白的禽大肠杆菌融合菌株的构建

对从陕西省主要养鸡地区病死鸡及鸡胚中分离的致病性禽源大肠杆菌,用SDS-PAGE进行Omp分型。采用不同浓度溶菌酶作用不同时间裂解细胞壁,制备原生质体,在高渗平板上再生培养;在药敏试验的基础上,结合Omp型分析,选择具有交叉耐药且Omp型不同的菌株,利用PEG诱导进行原生质体融合,在含双抗的高渗平板上筛选融合株,对不同代次的融合株分别进行革兰氏染色镜检、生化鉴定、血清型鉴定和Omp型分析。结果表明,所构建的融合菌株染色镜检和生化特性均符合大肠杆菌特征,75%融合子可凝集2亲本的O抗原,25%凝集其中1个亲本的O抗原;外膜蛋白型表现为1个或2个亲本的带型,但都有不同程度的增强。经稳定性检验证明其为遗传学上稳定的融合子。

应用原生质体融合技术构建纤维素发酵产油脂菌株的试验

原生质体融合(protoplast fusion)技术是将遗传性状不同的亲本原生质体融合杂交的基因重组技术。从健康桑树根系中分离到一株产油脂内生真菌MOD-1,采用酶解方法制备内生真菌MOD-1和产纤维素酶菌株绿色木霉TP4、T44及长柄木霉TL的原生质体,获得4个菌株的原生质体产量分别为7.02×10~6个/m L、4.43×10~6个/m L、6.35×10~6个/m L和4.35×10~6个/m L,再生率分别为4.90%、3.26%、4.51%和4.12%。优化亲本原生质体灭活条件为:MOD-1菌株经紫外线照射10 min或加热15 min,TP4菌株经紫外线照射25 min或加热20 min,T44菌株经紫外线照射25 min或加热25 min,TL菌株经紫外线照射30 min或加热25 min。在上述条件下各亲本原生质体的灭活率均达到100%。将灭活的MOD-1菌株原生质体分别与不同方式灭活的TP4、T44、TL菌株原生质体融合,经初筛和复筛获得了一株兼具MOD-1与TP4双亲优良性状的融合菌株MP-1,其油脂产量、油脂含量(质量分数)分别为0.082 4 g/L、14.46%,显著高于亲本菌株MOD-1。融合菌株MP-1传代培养10代后,油脂产量与油脂含量的遗传稳定性分别达到92.84%和95.00%。

原生质体融合选育高效菌株净化PVA工业废水的研究

从自然界样品中分离到 4株能降解聚乙烯醇的细菌 ,经紫外线诱变 ,得到 2株具有单重抗药性的突变菌株S7(Strs,Kanr)和K1 5(Strr,Kans) ,二者对PVA的去除率分别达到 52 %和58% 将S7和K1 5作为亲本菌株进行原生质体融合 ,用双重药物平板筛选融合子 通过正交试验 ,对原生质体融合的条件进行了优化 ,使融合率达到 4 60 3× 1 0 - 5 融合子F4菌株对PVA去除率达到 79 9% ,是原始菌株的两倍 ,将其培养成活性污泥后 ,PVA去除率可达 87% ,是普通活性污泥的 3～ 4倍

草菇V_9菌株栽培性状研究

利用原生质体融合菌株,通过优选试验,筛选出在产量、商品性状上优于对照V_(23),在温度上比对照种有较宽适应能力的菌株,以期应用于生产。

降解聚乙烯醇菌株原生质体的制备及融合

从自然界中分离得到 4株能降解聚乙烯醇 (PVA)的细菌 ,经紫外线诱变 ,得到两株具有单重抗药性的突变菌株S7(Strr,Kans)和K15 (Strs,Kanr) .系统分析了各种因素对原生质体制备率以及再生率的影响 ;将S7和K15作为亲本菌株进行原生质体融合 ,并通过正交试验 ,对原生质体融合的条件进行优化 ,使融合率达到 4 .6 0 3× 10 - 5.融合子F4菌株培养成活性污泥后 ,PVA降解率可达 87% ,是普通活性污泥的 3～

平菇种内原生质体分离与融合杂交育种技术及应用

将PDY液体培养的16个平菇资源品种的菌丝体,在25℃、pH5.8～6.0环境下,分别用1.5%溶菌酶+0.6mol/LKCl稳渗剂溶解其细胞壁2h,原生质体数得量最高;将获得的原生质体两两配对成39个组合,在30℃、pH9.0、0.6mol/LKCl稳渗剂、不加融合促进剂CaCl2和PEG6000的融合条件下,得到种内杂交融合子5株。其中有4株融合子再生出菌丝体和子实体;同皿接种实验显示,新菌株与其双亲具明显的拮抗性。经栽培试验与生产示范,新育的"优生1号"品系表现适应性强,优质、丰产、抗杂、耐热。

平菇种内原生质体分离与融合杂交育种技术的研究

将16个平菇资源品种的菌丝体,在25℃、pH5.8～6.0环境下,分别用1.5%溶菌酶加0.6mol/LKCl稳渗剂溶解其细胞壁2h,原生质体数得量最高。将获得的原生质体两两配对成39个组合,在30℃、pH9、0.6mol/LKCl稳渗剂、不加融合促进剂CaCl2和PEG6000的融合条件下,得到种内杂交融合子5株。其中4株融合子再生出菌丝体和子实体;同皿接种实验显示,新菌株与其双亲具明显的拮抗线。经栽培试验与生产示范,新育的“优生1号”品系表现适应性强,优质、丰产、抗杂、耐热。

原生质体融合选育赖氨酸高产菌种的研究

北京棒杆菌1134衍生株与枯草芽孢杆菌151衍生株的原生质体融合得到了一株可以甜菜糖蜜为原料,在摇床与小罐发酵均能稳定产赖氨酸6.50%以上的高产菌株——Q4413。Q4413菌落形态类似于1134株,而菌体形态区别于双亲,呈较短的杆状,无鞭毛,但有较稀疏的纤毛。生理生化研究表明:Q4413耐盐性、蔗糖发酵、石蕊牛奶试验产碱状况酷似151株,而与1134株略有差异;运动性、糊精、柠檬酸盐利用、MR 试验、酪素水解、明胶水解、石蕊牛奶还原,又酷似于1134株而区别于151株;Q4413的最适生长温度、pH 值居双亲之间;Q4413为原养型加三重抗性[Rif^r,AEC^r Nal^r];其细胞 DNA 含量与GC 比测定结果均居双亲之中,而且生物量测定结果也均与双亲有一定的差异。

桑黄原生质体融合菌株及其亲本生物学特性的比较研究

【研究目的】选择和评价桑黄原生质体融合菌株。【方法】应用聚丙烯酰胺垂直平板凝胶电泳技术,对5个供试菌株的酯酶同工酶进行测定,并对供试菌株进行液体培养,测定各菌株的生物量及发酵液中胞外多糖含量、总黄酮含量、酯酶活性及pH。【结果】融合菌株与亲本具有共同的基础条带,同时还产生了自身特异性条带,融合菌株SR002、SR003菌丝生物量是亲本SA04的3倍。SR005菌株合成胞外多糖速率最快,但SR002胞外多糖产量最高,较亲本SA02增加到1.8倍。融合菌株SR005在培养后期发酵液中酯酶活性最高。SR002、SR003两菌株亲缘关系极为相近。【结论】筛选得到的SR002菌株经进一步遗传稳定性验证后可用于以获得生物量、胞外多糖为目的的液体发酵培养。

原生质体融合构建直接转化淀粉生产燃料酒精的新型菌株

以K氏酵母、糖化酵母为亲本,采用单亲灭活原生质体融合技术进行属间融合,构建可直接转化淀粉产酒精的菌株。结果表明,取培养6～8 h的单倍体,在30℃下,用2.0%的蜗牛酶酶解1 h,均可获得高于92%的形成率及6.5%的再生率,制备好的原生质体经紫外线灭活糖化酵母后融合频率为7.3×10-6;最终获得一株性状稳定、酒精转化率高的融合子,在含5.0%的可溶性淀粉发酵液中,酒度可达7.0%(v/v)。

同种接合型酵母菌株Y2HGold的原生质体融合研究

为避开有性融合的局限性,挖掘同种接合型酵母菌株无性融合的潜在应用价值,利用质粒构建了酵母双杂交工程菌株Y2HGold的亮氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型菌株;接着采用酶解法进行四因素三水平正交实验获得原生质体制备方案:酶解温度30℃、处理时间80min、预处理剂含0.1%(w/v)巯基乙醇和0.1%(w/v)EDTA-2Na,酶解液为1.5%(w/v)蜗牛酶和1.5%(w/v)纤维素酶混合,使得原生质体的制备及再生率分别达82%和37%;最后采用PEG诱导融合的方法,经过同样正交实验得到Y2HGold无性融合条件为:PEG浓度35%、温度25℃、时间40min、pH5.8。筛选得到的无性融合子在遗传上稳定。

金针菇与凤尾菇科间原生质体融合研究

金针菇与凤尾菇皆属四极性异宗结合食用菌,其双核异核体菌株都具锁状联合遗传标记。本研究以金针菇和凤尾菇的双核异核菌株为亲本,将热灭活的凤尾菇原生质体,以PEG为融合剂,在高钙、高pH值条件下,与金针菇原生质体融合,结果从1329个再生菌株中选择出6株双亲细胞质和细胞核都融合的无锁状联合单核菌株,经融合核分裂技术处理后,融合核分裂成为具锁状联合的双核菌株。应用RAPD技术分析,证明融合子菌株均含有与双亲株同源的遗传物质,是真正的融合子菌株。

利用原生质体融合技术构建梨酒酵母工程菌

以菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YDJ05及产香酵母Issatchenkia orientalis YS03为融合亲本X和Y,通过原生质体融合技术构建适合梨酒酿造的酵母工程菌,研究结果表明:利用EMS诱变亲本菌株Y,得到了一株精氨酸营养缺陷型菌株,亲本菌株X和Y采用蜗牛酶液在35℃下处理100min,得到菌株X、Y的原生质体融合率分别为93.6%、94.2%,再生率分别为27.8%、31.6%。以加热的方式灭活亲本菌株X,灭活时间为14min。在以PEG为促融剂的条件下对两株菌进行原生质体融合,经过优选得到融合子DJ02,其产酒精率、产香率等指标最优,分别达到了9.87%、0.37g/L。

Fhhh工程菌株降解PTA废水动力学研究

研究了工程菌株Fhhh降解精对苯二甲酸 (PTA)石化废水的动力学 .将测得的Fhhh降解废水的 6项动力学参数值、废水自然参数值、废水排放标准控制值 ,输入环境生物技术信息学软件 (Ebis)进行计算 .结果表明 ,来源于 3种保存方法的Fhhh菌株中 ,所需反应器的最小体积 (Vmin)为 1 30 9m3 ,比降解率 (qA)的最高数值为0 0 1 36h- 1,是土著菌YZ1的 4倍 ,高于国内外同类研究的 4项数值 ,低于同类研究的 2项数值 .结果表明 ,Fhhh工程菌株具有降解PTA废水的显著优势 .

工程菌对染料脱色性能的研究

采用原生质体融合技术,构建了脱色工程菌H-1,它可同时对结构差异大的还原大红R和蓝色盐VB染料进行脱色。确定了工程菌H-1的较佳脱色条件为厌氧、30℃、pH=7、接种量为3g·L-1。对色度为417倍、631倍、812倍、1093倍的上述两种染料培养基分别脱色12h,其中H-1对色度为417倍的蓝色盐VB的脱色率为85.5%,对还原大红R的脱色率为90.1%;对色度为1093倍的蓝色盐VB的脱色率为81.3%,对还原大红R脱色率为86.5%。同时用单株原始菌株与混合菌对相同浓度的染料培养基脱色,对各菌的脱色结果进行了理论分析。工程菌扩大了脱色种类,提高了降解速率,具有广阔的应用前景。