pshRNA-MDRla联合TRAIL基因对胃癌细胞株SGC7901/VCR作用及其作用机制的实验研究

目的:探讨pshRNA-MDRla联合pBUD-TRAIL,在体外对胃癌细胞SGC7901/VCR增殖和凋亡的作用及机制,为肿瘤的基因治疗奠定基础。方法:以人胃癌SGC7901/VCR细胞株为研究对象,将pshRNA-MDRla与pBUD-TRAIL共同转染胃癌SGC7901/VCR细胞并在VCR中培养,同时与pshRNA-MDRla组、pBUD-TRAIL组、SGC7901/VCR和空质粒组相比较,以MTT法检测细胞增殖抑制率、以FCM检测细胞凋亡率以及TUNEL法检测细胞凋亡等,观察联合应用组对肿瘤细胞增殖的抑制作用。结果:MTT法显示:对照组(pBUD-TRAIL、pshRNA-MDRla、空质粒和SGC7901/VCR组)胃癌细胞的生长抑制率分别为45%、30%、10%和10%,联合实验组抑制率为70%;FCM检测显示:对照组胃癌细胞的凋亡率分别为25.96%、10.27%、5.96%和4.25%,联合实验组凋亡率为41.23%;与对照组相比,联合实验组抑制率和凋亡率都具有显著性差异;TUNEL检测结果显示:联合组与其他对照组相比较,细胞核明显棕黄色深染,且阳性染色细胞数目明显增多,表明pBUD-TRAIL与pshRNA-MDRla联合作用,凋亡细胞明显增加。结论:pshRNA-MDRla联合pBUD-TRAIL可显著抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡,推测与pshRNA-MDRla阻止TRAIL外排有关,从而增强TRAIL促进肿瘤细胞凋亡的作用,两者具有协同作用。

pshRNA-survivin脂质体的制备及初步稳定性考察

目的:制备包封率高、粒径均匀、稳定性好的pshRNA-survivin脂质体,并对其质量进行评价。方法:采用逆相蒸发法制备pshRNA-survivin脂质体;正交设计优选制备处方;考察脂质体的粒径分布、zeta电位;用超滤离心法测定脂质体的包封率;离心加速实验与渗漏率的测定考察脂质体的稳定性。结果:所得优化处方为磷脂与药物比为100∶1,油水比为4∶1,磷脂与胆固醇之比为1.5∶1,旋转蒸发温度为37℃;以优化处方制得的脂质体平均粒径为123.4 nm,zeta电位为(-8.42±0.88)mV,平均包封率达77.9%。结论:选用逆相蒸发法优化pshRNA-survivin脂质体处方合理,工艺简便可行,包封率高,稳定性好。

Chitosan/pshRNA Plasmid Nanoparticles Targeting MDR1 Gene Reverse Paclitaxel Resistance in Ovarian Cancer Cells

In order to investigate the effect of chitosan/pshRNA plasmid nanoparticles targeting MDR1 genes on the resistance of A2780/TS cells to paclitaxel, chitosan/pshRNA plasmid nanoparti- cles were synthesized by means of a complex coacervation technique and transfected into A2780/TS cells. The cells transfected with MDRl-targeted chitosan/pshRNA plasmid nanoparticles were experimental cells and the cells transfected with chitosan/pGPU6/GFP/Neo no-load plasmid nanoparticles served as negative control cells. Morphological features of the nanoparticles were observed under transmission electron microscope （TEM）. MDR1 mRNA expression was assessed by RT-PCR. Half-inhibitory concentration （IC50） ofpaclitaxel for A2780/TS cells was determined by MTT method. TEM showed that the nanoparticles were round-shaped, smooth in surface and the diameters varied from 80 to 120 nm. The MDR1 mRNA in the transfected cells was significantly decreased by 17.6%, 27.8% and 52.6% on the post-transfection day 2, 4 and 7 when compared with that in A2780/TS cells control （P〈0.05）. MTT assay revealed that the relative reversal efficiency was increased over time and was 29.6%, 51.2% and 61.3% respectively in the transfected cells 2, 4, 7 days after transfection and IC_50 （0.197±0.003, 0.144±0.001, 0.120±0.004） were decreased with difference being significant when compared with that in A2780/TS （0.269±0.003） cells control （P〈0.05）. It was concluded that chitosan/pshRNA plasmid nanoparticles targeting MDR1 can effectively reverse the paclitaxel resistance in A2780/TS cells in a time-dependent manner.

shRNA靶向干扰COX-2促进人肝癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡

目的:探讨重组干扰质粒pshRNA-COX-2对人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡的促进作用。方法:重组干扰质粒pshRNA-COX-2转染Hep3B细胞并筛选后,将被成功转染的Hep3B细胞种植于裸鼠皮下,测量肿瘤大小,成瘤4周后处死裸鼠,绘制肿瘤生长曲线,RT-PCR和Western blot检测肿瘤组织中COX-2 mRNA和蛋白表达,电镜观察和TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。结果:与空白组相比,干扰组肿瘤组织中COX-2 mRNA和蛋白表达抑制率分别为48.5%和61.4%。干扰组最终瘤体大小明显小于阴性组和空白组<P<0.01)。电镜观察显示干扰组凋亡细胞增多,TUNEL法显示干扰组肿瘤细胞凋亡指数明显高于阴性组和空白组(P<0.01)。结论:pshRNA-COX-2通过靶向抑制COX-2基因表达,可明显抑制人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤生长,促进肿瘤细胞凋亡。

shRNA靶向干扰COX-2抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤及其血管生成

目的:探讨重组干扰质粒pshRNA-COX-2对人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤血管生成的抑制作用。方法:重组干扰质粒pshRNA-COX-2转染Hep3B细胞并筛选后,RT-PCR和Western blot检测COX-2mRNA和蛋白表达,RT-PCR检测VEGFmRNA表达。将被成功转染的Hep3B细胞种植于裸鼠皮下,测量肿瘤大小,4周后处死裸鼠,免疫组织化学法检测肿瘤组织中COX-2蛋白表达和肿瘤微血管密度(MVD)。结果:与未转染细胞相比,干扰组COX-2mRNA和蛋白表达抑制率分别为65.3%和52.8%(P<0.05),干扰组VEGFmRNA表达抑制率为56.5%(P<0.05)。干扰组瘤体大小明显小于阴性组和空白组(P<0.01)。干扰组COX-2得分和MVD均明显低于阴性组和空白组(P<0.01)。结论:pshRNA-COX-2通过抑制COX-2表达明显抑制人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤血管生成。

RNA干扰抑制端粒酶反转录酶联合γ射线对人喉癌细胞的作用

目的观察人端粒酶反转录酶特异性干扰载体（pshRNA-hTERT）联合放射线在细胞和动物模型水平上对人喉鳞癌Hep-2细胞株的生长抑制作用，研究抑制hTERT在放射增敏中的作用。方法细胞水平：联合pshRNA-hTERT和γ射线作用于人喉癌细胞Hep-2，用TRAP-PCR，ELISA法检测端粒酶活性，彗星电泳检测DNA损伤；动物水平：建立Hep-2和Hep-2R移植瘤模型，瘤内注射pshRNA-hTERT并联合放射线观察对移植瘤的抑制作用，TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡，免疫组织化学法检测肿瘤内hTERT蛋白的表达。结果转染pshRNA-hTERT后Hep-2细胞hTERT的mRNA表达抑制率为60.78％；pshRNA-hTERT不仅能抑制Hep-2细胞的端粒酶活性，而且抑制照射后DNA损伤的修复；在移植瘤模型中，pshRNA-hTERT与放射线有协同抑制移植瘤生长的作用（Hep-2：EPO=1.79；Hep-2R：EPO=2.01）。结论pshRNA-hTERT在细胞和动物实验水平均具有放射增敏作用，表明抑制端粒酶及其亚单位可以增加在体肿瘤的放射敏感性，这为喉癌的基因放疗研究提供了依据。

靶向H-ras基因的小干扰RNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

目的:探讨脂质体介导的靶向H-ras基因的小发夹状RNA重组质粒对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖的抑制作用。方法:实验分4组:正常对照组(仅予脂质体处理)、转染psh RNA/H-ras处理24h组、48h组及72h组。分别于转染后不同时间进行MTT实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期检测和AO/EB双染实验,观察各组细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化。结果:FCM显示转染psh RNA/H-ras 24h及48h后的SKOV3细胞均出现细胞周期的抑制,48h后SKOV3细胞有显著的凋亡发生;转染psh RNA/H-ras1和pshRNA/H-ras2对SKOV3细胞克隆形成的抑制率分别为51.5%(P<0.05)和63.3%(P<0.01);MTT检测转染psh RNA/H-ras1和psh RNA/H-ras 272h后对SKOV3细胞增殖抑制率分别为62.5%和64.5%。AO/EB实验显示48h细胞的凋亡率为29.3%(P<0.05)。结论:重组质粒psh RNA/H-ras在人卵巢癌SKOV3细胞中有明显抑制细胞增殖的作用,并介导肿瘤细胞的凋亡。