PstS1-卡介苗重组疫苗的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌蛋白磷酸盐特异转运系统1(PstS1)的重组卡介苗。方法:以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,通过PCR扩增获得PstS1基因序列;将PstS1基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达质粒PMD31重组,得到S-PMD31重组质粒,对S-PMD31重组质粒进行HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌,用IPTG对工程菌株进行诱导表达,并通过电穿孔技术将S-PMD31重组质粒导入卡介苗中构建重组卡介苗。结果:用引物P1、P2对结核分枝杆菌H37RV基因组进行PCR扩增获得长为1 100 bp的PstS1基因序列,S-PMD31重组质粒的HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定证实:PstS1基因正确插入载体PMD31中,并能在大肠杆菌中诱导表达。通过质粒提取及PCR扩增表明重组质粒正确导入卡介苗中。结论:成功地构建了PstS1重组卡介苗,预期能提高卡介苗的免疫原性和保护力。

结核分枝杆菌宁夏分离株pstS1基因在毕赤酵母中的表达

目的亚克隆结核分枝杆菌宁夏分离株pstS1基因,构建pPICZα-A-S1表达载体,并在毕赤酵母表达系统中分泌表达,为pstS1基因所表达的蛋白功能的研究奠定基础。方法 PCR方法亚克隆结核分枝杆菌宁夏分离株pstS1基因片段,构建毕赤酵母表达载体pPICZα-A-S1,重组质粒线性化之后电转化到在毕赤酵母表达菌株SMD1168感受态细胞中,挑选阳性克隆菌株并用甲醇进行诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定。结果构建了结核分枝杆菌pPICZα-A-pstS1重组质粒,以甲醇进行诱导,经过SDS-PAGE电泳进行分析,结果显示pstS1基因表达出了大约为38kD的蛋白,经过Western blot分析,分泌的蛋白与结核分支杆菌38KD抗血清能够特异性的识别。结论结核分枝杆菌pstS1基因可以在毕赤酵母中进行很好的分泌表达,为以后pstS1基因的表达产物在疫苗研制、诊断血清研究等方面的应用奠定了基础。

结核分枝杆菌宁夏分离株pstS1基因的扩增及生物信息学分析

目的扩增编码结核分枝杆菌(宁夏分离株)38kDa蛋白的pst S1基因,运用生物信息学方法和软件预测其编码蛋白的生物学特性,为早期结核病的诊断以及新的抗结核药物的研制奠定基础。方法采用聚合酶链式反应(PCR),从结核分枝杆菌(宁夏分离株)基因组中扩增出pst S1基因,对其核苷酸序列进行测定;利用序列对比分析和蛋白质结构预测软件进行生物信息学分析。结果获得的pst S1基因的全长1112bp与预期大小基本一致,基因序列与GenBank公布的MTB标准株(ATCC27294)基因序列的核苷酸同源性为92.7%,初步预测出该蛋白的分子特征、抗原性和二级结构。结论成功扩增MTB(宁夏分离株)pst S1基因,通过生物信息学分析获得了该蛋白的信息特征,为进一步研究其生物学功能和免疫学活性奠定了基础。

中国结核分枝杆菌复合群菌株pstS1基因中人T/B细胞表位多态性分析

目的研究我国结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)菌株中pstS1基因及其中的人T细胞和B细胞表位区的序列多态性。方法选取180株临床分离MTBC菌株及11株世界不同来源的BCG疫苗株,PCR扩增其pstS1基因并测序后,结合已经公布的1株牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)及3株BCG菌株的pstS1基因序列,与从免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)中查询到的表位序列进行比对和分析,总结该基因序列中的变异特征。结果在所有菌株中,共发现2个单碱基插入造成的移码突变(Frame-shift mutation)和4个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,共造成79.17%(19/24)的B细胞表位和65.22%(15/23)T细胞表位区的序列变异。pstS1基因的dN值为0.000 14,其中T细胞表位区与非T细胞表位区的dN值分别为0.000 17和0.000 05,B细胞表位区与非B细胞表位区的dN值分别为0.000 23和0,由于未发现同义突变位点,所有序列区的dS值均为零。结论 MTBC菌株的pstS1基因具有较高的序列多态性,且其中的T、B细胞表位区具有更高的多态性水平。

结核杆菌H37Rv株重组PstS1蛋白的表达纯化及其免疫反应性分析

目的表达、纯化结核杆菌H37Rv株重组PstS1(简称rPstS1)蛋白,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础。方法重组质粒pET15b-PstS1转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导rPstS1蛋白表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后,优化表达条件,用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rPstS1蛋白,并用斑点金免疫渗滤法评价纯化蛋白的免疫反应性。结果成功构建了重组质粒pET15b-PstS1,相对分子质量为38×103的rPstS1蛋白约有30%以可溶性蛋白形式表达,经亲和层析后的rPstS1蛋白纯度为94.8%,有较好的免疫反应性。结论构建的重组质粒pET15b-PstS1能高效表达有免疫反应性的rPstS1蛋白,经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白。

结核分枝杆菌PstS1和HspX蛋白的免疫反应性及诊断价值评价

目的:评价结核分枝杆菌PstS1和HspX蛋白的体液和细胞免疫反应性,为结核病免疫学诊断和疫苗候选抗原的筛选提供参考。方法:利用分子克隆表达和Ni 2+亲和层析技术纯化获得重组目的蛋白PstS1和HspX。收集健康志愿者和结核分枝杆菌感染志愿者血液样本及其背景流行病学资料,以重组PstS1和HspX蛋白作为抗原,进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分别检测特异性IgG抗体和分泌IFN-γ的抗原特异性T淋巴细胞。对数据进行统计学分析,评价重组PstS1和HspX蛋白的体液和细胞免疫反应性。 结果:重组PstS1和HspX蛋白均能特异性刺激结核分枝杆菌感染者体内较多的效应T细胞分泌IFN-γ,结核分枝杆菌感染组与健康对照组的检测结果差异有统计学意义( P<0.01);重组PstS1和HspX蛋白作为ELISPOT诊断抗原的特异度和灵敏度分别为92.11%(35/38)和65.96%(31/47),68.42%(26/38)和91.49%(43/47)。重组PstS1和HspX蛋白也具有一定的体液免疫反应性,但仅HspX蛋白特异性抗体水平在结核分枝杆菌感染组与健康对照组间的差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:重组PstS1和HspX蛋白均具有较好的细胞免疫反应性,属于细胞免疫优势抗原。两者均具有较好的细胞免疫诊断性能,同时也是较好的潜在抗结核疫苗候选抗原。

磁控溅射法制备具有同质缓冲层的PST薄膜

采用射频磁控溅射法制备了以低功率溅射得到的PbxSr1-xTiO3(PST)薄膜为缓冲层(同质缓冲层)的PST双层薄膜。通过X-射线衍射、扫描电镜、阻抗分析仪和铁电分析仪对薄膜相结构、表面形貌、介电损耗和铁电性能进行了测试分析。结果表明,以低功率溅射得到的PST薄膜作为同质缓冲层的双层薄膜可减少薄膜的缺陷,从而有效降低介电损耗。

运用均匀设计法优化pST1-K99在原核系统中的表达

运用均匀设计法,对影响pST1-K99在大肠杆菌中表达的因素进行了优化,摸索出了对周质蛋白进行诱导表达的最佳条件,即pH=6.0,装液量30 mL,IPTG终浓度0.484 mmol/L,IPTG诱导时间6 h,诱导温度34℃.在此条件下,所表达的目的蛋白的平均密度从0.14提高到0.20,比优化前提高了43%.