水稻淀粉脱分支酶基因PUL对稻米理化品质的影响

为了研究PUL基因的变异对稻米蒸煮食味品质的影响,分别以籼稻品种桂朝2号和粳型糯稻品种苏御糯互为供体和轮回亲本,通过分子标记辅助选择,经过多代回交构建了PUL基因的近等基因系,分析了各近等基因系和轮回亲本的蒸煮品质指标。结果表明,近等基因系与轮回亲本在直链淀粉含量、胶稠度和淀粉晶体结构等指标上没有显著差异,而淀粉的热力学特性和淀粉黏滞性等指标存在显著的变化。说明PUL基因是影响稻米蒸煮品质的重要基因之一。来源于籼稻桂朝2号和粳稻苏御糯的PUL等位基因在功能上已经发生明显的分化。本研究中基于PUL基因序列差异设计的分子标记可以直接用于水稻品质的改良。

酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子eIF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子eIF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.

人DNAJB6蛋白与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的鉴定

pUL23是人巨细胞病毒(HCMV)UL23基因编码的皮层蛋白.HCMV皮层蛋白与病毒颗粒的形成、病毒转移、免疫调控等病毒生活过程相关.利用GAL4酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,获得与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白分子DNAJB6[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily B,member 6].回复酵母双杂交、体外GST-Pull down和免疫共沉淀试验再次确认两者之间的相互作用.该结果为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.

人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23与宿主蛋白IGFBP4相互作用的鉴定

目的:利用蛋白质相互作用的技术筛选与pUL23相互作用宿主蛋白,为研究pUL23蛋白对人巨细胞病毒繁殖的影响提供线索。方法:通过酵母双杂交系统从人胚肾cDNA文库筛选与pUL23相互作用的宿主蛋白;通过GST-pu ll-down技术研究二者体外物理性相互作用;免疫共沉淀技术进一步研究二者在胞内相互作用。结果:Pu ll-down技术、免疫共沉淀技术确定了宿主蛋白IGFBP4与pUL23具有相互作用。结论:上述结果为研究pUL23蛋白调节病毒自身繁殖功能提供重要依据。

轧钢厂一种基于Pul的生产存储控制系统

有效的生产存储控制系统对企业生产具有重要意义．本文介绍了一种基于Ｐｕｌ的生产存储控制系统：ＣＯＮＷＩＰ系统，提出了冷轧厂ＣＯＮＷＩＰ系统的设计方案，并给出在生产线存在瓶颈的情况下。

基于左连续伪T-模的非可换模糊逻辑系统PUL＊

对P.Hájek建立的模糊逻辑系统psMTL进行了扩充,基于一般左连续伪T-模提出了非可换模糊逻辑系统PUL＊,证明了它的可靠性定理.同时,以PUL＊系统的Lindenbaum代数结构为背景引入PUL＊.代数概念,建立了相应的滤子理论,得到PUL＊-代数的正规素滤子定理,借此证明了PUL＊系统的完备性.

人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部结构模拟和突变分析

目的初步探索人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部序列(329～572aa)的三维模拟结构并进行突变的耐药分析。方法采用巢式PCR方法扩增UL97基因776 bp片段并测序,以此发现非同义突变;然后利用SWISS-MODEL结构模拟综合服务器和其他相关软件比对模式对野生型PUL97蛋白片段进行同源模建并优化,通过各种指标或服务器来评估模拟结构的优劣并作筛选。将筛选所得的最佳模拟结构用于非同义新突变型的初步耐药分析。结果最终筛选出的模拟结构是以1YDTE为模板,以L1.FASTA为比对文件所得的Model A。整个分子的能量最低,ProQ的预测分数最高。分子对接分析也发现了潜在的ATP和GCV结合口袋。利用已知的阴阳性耐药点突变验证了该结构的合理性。同时根据突变前后结构信息的改变,提示C518Y单点突变以及联合突变(E517G和C518Y)呈现高度可疑的耐药特性。结论 PUL97野生型蛋白计算机结构模拟和突变分析法是初步评估新突变型耐药特性的又一方便快捷的方法 ,可用于实验验证前的筛选;但模拟结构本身的准确性是成功运用该方法的前提。

基于PUL算法及高分辨率WorldView影像的城市不透水面提取

准确提取城市不透水面对生态环境、水热循环及热岛效应等研究具有重要意义。该文利用WorldView高分辨遥感影像,提出基于PUL(Positive and Unlabeled Learning)算法的高分辨率影像城市不透水面提取方法,该方法不需要负样本数据,只需少量的正样本和未标记样本即可训练分类模型。结果显示,PUL算法的提取结果优于一类支持向量机(OCSVM)以及最大熵(MAXENT)模型。使用不同正样本量时,PUL的提取结果总体精度和kappa系数均优于OCSVM和MAXENT,最高总体精度为91.27%,最高kappa系数可达0.8255,可快速、有效地从高分辨率遥感影像中提取不透水面。

ATPase抑制因子1是与HCMV pUL23蛋白相作用的宿主蛋白分子-酵母双杂交技术筛选与鉴定

目的:利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒相互作用的宿主蛋白分子,为探讨人巨细胞病毒pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据。方法:利用GAL4酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,以获得与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用的宿主蛋白分子,再通过回交试验和体外GST-pulldown试验验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交筛选得到宿主蛋白分子ATPase inhibitory factor1(ATIF1),回交试验和体外GST-pulldown试验再次确认ATIF1能够与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用。结论:pUL23确实能够与ATIF1相互作用,它们之间的相互作用可能为研究pUL23在病毒生活周期发挥的功能提供依据。

回交重组自交系中SSⅢ-1、SBE3和PUL基因对稻米蒸煮食味品质的影响

该研究利用颗粒结合淀粉合成酶基因(Wxb)与可溶性淀粉合成酶Ⅱa基因(SSⅡ-3)均相同的籼型光温敏核不育系‘广占63S’和潜力恢复系CG173R为亲本,经过回交和多代自交,以构建的回交重组自交系(BILs)BC1F10代株系为供试材料,分析各株系的基因型组成及其蒸煮食味品质(ECQs)和RVA谱,以解析与品质相关微效基因的遗传效应。结果显示:(1)双亲在焦磷酸化酶大亚基基因(AGPlar)、分支酶基因Ⅲ(SBE3)、脱分支酶基因(PUL)、可溶性淀粉合成酶Ⅰ基因(SSⅠ)和可溶性淀粉合成酶SSⅢ-1基因(SSⅢ-1)的基因位点存在差异。(2)SSⅢ-1、SBE3和PUL基因分别在BC1F10代株系中存在单基因分离,SSⅢ-1和SBE3基因、SSⅢ-1和PUL基因在BC1F10代株系中均存在双基因的分离。(3)不同基因型及其互作与蒸煮食味品质(ECQs)中的表观直链淀粉含量(AAC)、胶稠度(GC)以及RVA谱的部分特征值存在显著或极显著的效应。(4)SSⅢ-1单基因只对AAC有极显著影响;SBE3基因和SSⅢ-1基因互作对AAC有极显著影响,对峰值时间(PeT)、成糊温度(PaT)、GC有显著性影响;PUL基因和SSⅢ-1基因互作对PeT、PaT和回复值(CSV)有极显著影响,对最高粘度(PKV)、热浆粘度(HPV)、崩解值(BDV)、冷浆粘度(CPV)、消减值(SBV)、AAC和GC有显著影响。研究表明,在Wxb和SSⅡ-3基因背景下,参与淀粉合成的微效基因SSⅢ-1与SBE3和SSⅢ-1的互作效应极显著影响水稻AAC,SBE3和SSⅢ-1的互作效应与PUL和SSⅢ-1的互作效应显著影响GC,PUL和SSⅢ-1的互作效应极显著影响PaT,这些发现将对改良稻米品质和加快水稻优质育种具有重要意义。

CRISPR/Cas9技术编辑淀粉合成基因PUL

利用CRISPR/Cas9技术对调控稻米脱支酶基因PUL定点编辑,获得了具有重要育种价值的PUL等位变异。首先设计2个guide RNA(gRNA)靶位点,构建OsPUL,基因定点编辑载体pC1300-Cas9。然后利用农杆菌介导侵染水稻材料中花11,提取T0代转基因植株的基因组DNA,并对编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明,T0代材料中PUL的突变频率高达90%,其中纯合缺失突变率约占51%。对T1代纯合缺失突变体的千粒重性状的调查分析结果表明,部分pul的缺失突变能显著提高千粒重(大于5%)。通过RT-PCR分析T0代突变体中相关基因表达表明,目的基因PUL、支链淀粉相关基因和粒重负调控相关基因(GS3和GW8)表达降低,而粒重正调控相关基因(GL7)表达增加。不同类型pul突变体的成功创建丰富了PUL的变异类型,为水稻遗传改良提供了重要的遗传材料。

马立克氏病病毒多次跨膜蛋白pUL43多克隆抗体的制备及其体外表达分析

为了研究马立克氏病病毒(MDV)pUL43蛋白的表达特征,首先通过同源重组反应构建了表达MDV pUL43蛋白的真核载体,利用生物信息学软件分析MDV pUL43蛋白的跨膜结构、亲水性、疏水性和抗原性,选择抗原性最佳的N端第259~276位合成抗原肽,5次免疫兔后采集血清并通过亲和层析纯化浓缩多克隆抗体,利用斑点杂交对多克隆抗体效价进行检测,利用实时荧光定量(RT-qPCR)检测感染细胞UL43基因mRNA转录本水平,利用间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹对转染或被MDV感染细胞的pUL43蛋白进行检测。结果显示:多克隆抗体与抗原肽的反应效价为1∶100000;转染细胞内pUL43蛋白呈斑块聚集;814疫苗株或GX20NNM1野毒株感染后UL43基因在mRNA、蛋白水平上具有相似的表达动力学。在感染后12 h检出特异性的pUL43蛋白,其表达量随感染时间延长而增加;特异条带的表观分子量在45~50 ku。研究成功制备了特异性MDV pUL43蛋白多克隆抗体,并分析了MDV pUL43蛋白的体外表达特征,为后续研究其生物学功能奠定了基础。

人巨细胞病毒编码蛋白pUL23在E.coliBL21(DE3)中的表达和纯化

大肠杆菌中高效表达携带组氨酸标签的人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23,并进行纯化以及鉴定。提取感染HCMVTowne病毒株的HFF细胞的总RNA,逆转录为cDNA作为模板,经PCR获得UL23的基因片段,将此片段插入表达载体pET-28a(+),构建pET28a(+)-UL23重组质粒。将pET28a(+)-UL23转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达。表达产物经Western blotting分析后进行发酵,再用Ni sepharose亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,成功构建pET28a(+)-UL23原核表达载体,表达及纯化了His-pUL23融合蛋白,为进一步研究pUL23奠定基础。

伪狂犬病病毒pUL34核膜定位和功能的结构性决定因素研究

疱疹病毒蛋白pUL34和pUL31在内核膜(INM)形成的复合物对于有效的核释出是必需的。伪狂犬病病毒(PRV)pUL34是含262个氨基酸(AA)的Ⅱ型膜蛋白。预测跨膜区(TM)位于245-261位,C端只有一个氨基酸,可能延伸到核周间隙。在缺失其他病毒蛋白时,其靶向核膜的固有定位基序,其结构与细胞INM蛋白,如Lap2β和Emer-in相似。为研究pUL34中与定位和功能有关的结构域,通过用细胞INM蛋白区域替换pUL34部分区域构建了嵌合蛋白。将C端18个氨基酸,包括TM替换为Lap2β和Emerin的TM和C端结构域,或核纤层蛋白B受体(LBR)的第一个TM,包括其后的9个氨基酸。所有由此产生的嵌合蛋白都弥补了PRV-ΔUL34的复制缺陷,表明TM的替代和C端结构域的扩展都不会干扰pUL34的功能。当C端50个氨基酸用相应的Lap2β序列取代(pUL34-LapCT50),其互补作用降低,但并没有阻断。然而,C端100个氨基酸(pUL34-LapCT100)替换后虽然仍能与pUL31结合,但会产生一个无功能的蛋白,说明这个区域在蛋白质功能中起着重要的作用。N端100个氨基酸(pUL34-LapNT100)的替换对核膜定位没有影响,但能阻断pUL31的结合和功能。

伪狂犬病病毒pUL34核膜定位和功能的结构性决定因素研究

疱疹病毒蛋白pUL34和pUL31在内核膜(INM)形成的复合物对于有效的核释出是必需的。伪狂犬病病毒(PRV)pUL34是含262个氨基酸(AA)的Ⅱ型膜蛋白。预测跨膜区(TM)位于245-261位,C端只有一个氨基酸,可能延伸到核周间隙。在缺失其他病毒蛋白时,其靶向核膜的固有定位基序,其结构与细胞INM蛋白,如Lap2β和Emer-in相似。为研究pUL34中与定位和功能有关的结构域,通过用细胞INM蛋白区域替换pUL34部分区域构建了嵌合蛋白。将C端18个氨基酸,包括TM替换为Lap2β和Emerin的TM和C端结构域,或核纤层蛋白B受体(LBR)的第一个TM,包括其后的9个氨基酸。所有由此产生的嵌合蛋白都弥补了PRV-ΔUL34的复制缺陷,表明TM的替代和C端结构域的扩展都不会干扰pUL34的功能。当C端50个氨基酸用相应的Lap2β序列取代(pUL34-LapCT50),其互补作用降低,但并没有阻断。然而,C端100个氨基酸(pUL34-LapCT100)替换后虽然仍能与pUL31结合,但会产生一个无功能的蛋白,说明这个区域在蛋白功能中起着重要的作用。N端100个氨基酸(pUL34-LapNT100)的替换对核膜定位没有影响,但能阻断pUL31的结合和功能。

创意孵化器 维也纳PULS Vario办公室

创新和创造力是企业生命长存的核心所在,招募合适的员工是第一步,但同样重要的是提供一个有抱负的工作空间。PULS Vario是德国PULS工程集团设于奥地利维也纳的研发子公司,它专注于研究和开发,并为关键客户提供定制解决方案。2018年3月,瑞士建筑和设计工作室Evolution Design为PULS Vario创建了一个可专注于创新的1000 m^2工作空间。

PULS-DIMENSION电源

德国PULS电源公司推出了新一代的导轨式开关电源DIMENSION。这种新型电源效率高达95．5％，体积为96毫米×157毫米×122毫米，电源输出功率为1kW。

马立克病病毒pUL56蛋白对DF-1细胞免疫通路相关基因的转录调控研究

马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)UL56基因编码α-疱疹病毒同源蛋白pUL56。为全面了解该病毒蛋白与宿主细胞的互作关系,本研究首先将表达红色荧光蛋白标记的MDV pUL56质粒转染鸡DF-1细胞系,瞬时表达蛋白的细胞经流式细胞术分选,富集阳性细胞群进行高通量测序及mRNA转录组分析。测序结果显示,表达pUL56的DF-1细胞存在914个差异表达基因,其中462个上调,452个下调。通过GO、KEGG和Reactome通路富集分析,发现富集的显著差异表达基因分布于先天性免疫反应、细胞因子产生等相关信号通路。在此基础上,随机选取了I型干扰素信号通路和促炎症细胞因子基因进行RT-qPCR验证,IFI6、IFIH1、CD83、HSP90AA1、IL-1β和IL-8L1基因的表达量均为上调,而IL-12β表达则下调,该结果与高通量测序相符。本研究提示pUL56作为非结构蛋白,可能对宿主细胞过程有广泛的调节作用。

Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少。本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型。将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3GUL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体。运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF。遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达。感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响。限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确。病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高。在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白。这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达。Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间。这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础。

人巨细胞病毒蛋白PUL23与干扰素诱导蛋白NMI相互作用鉴定

目的鉴定人巨细胞病毒蛋白PUL23与干扰素诱导蛋白NMI相互作用。方法以PUL23为诱饵蛋白筛选获得干扰素（interferon，IFN）诱导蛋白NMI，经体外回复酵母双杂交实验、GST—Pulldown和免疫共沉淀技术再次确认PUL23和NMI（N—Mycinteractor）的胞内相互作用。结果回复酵母双杂交实验、GST—Pulldown和免疫共沉淀确认PUL23和NMI具有相互作用。结论PUL23和NMI的相互作用为HCMV参与宿主免疫逃逸过程研究奠定基础。