深圳市伤寒PulseNet数据库的初步建立与应用

[目的]建立深圳市伤寒PulseNet数据库,用于伤寒的实时监测和分子流行病学调查。[方法]采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术,对深圳市2002～2005年106株伤寒的染色体DNA进行酶切,用BioNumerics软件对PFGE分型图谱电子化数据分析,建立分子分型数据库。[结果]深圳市各年的伤寒菌株变异较多,呈现30多种PFGE图谱。同一起伤寒暴发的临床分离株具有相同的PFGE图谱。[结论]深圳市伤寒PulseNet数据库的初步建立,对直观地分析各起疫情之间的相互关系,对疫情的控制和传染来源的追踪具有重要意义。

福建省嗜肺军团菌血清1型及血清6型菌株PFGE分型研究

目的研究福建省2008年至2010年公共场所空调冷却塔水及冷凝水中分离的嗜肺军团菌血清Ⅰ型(LP1)及血清Ⅵ型(LP6)的基因特征。方法应用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术对57株LP1型军团菌及15株LP6军团菌进行电泳,并用BioNumerics(version 6.0,Applied Maths,Inc)软件包对其进行聚类分析。结果 57株LP1军团菌可分为40种PFGE型,菌株间相似性系数在24.107%～100.000%之间不等,大部分菌株的PFGE型别差异明显,无优势型别。不同地区分离的LP1军团菌既有差异较大的带型,也存在相同和相似的带型;相同地区,菌株间相似性系数存在差异,无优势菌株。15株LP6军团菌可分为12个不同的PFGE型别,菌株间相似性系数在27.87%～100.00%之间。结论 2008-2010年福建省公共场所空调冷却塔水及冷凝水中分离的LP1及LP6军团菌呈现基因多样性。

嗜肺军团菌SBT、PFGE、AFLP分子分型方法的比较

比较SBT、PFGE、AFLP三种分子分型方法在嗜肺军团菌分型研究中的分辨力,探讨SBT方法在嗜肺军团菌分型中的可应用性。收集石家庄市6所医院冷却塔水中分离的32株嗜肺军团菌,对其中的24株血清I型嗜肺军团菌进行SBT分型研究,并与PFGE和AFLP分型结果进行了比较。24株LP1型嗜肺军团菌共分为4个ST型,分辨系数为0.239 1。PFGE方法将32株菌株共分为15个PFGE型,分辨系数为0.925 4。AFLP方法将32株菌株分为23个AFLP型,分辨系数为0.973 7。通过比对EWGLI网站SBT数据库,ST1021型和ST345型为本地区独特型别且属于同一克隆系;ST1型为优势型别并在我国长期流行;由于缺失neuA而未分型的嗜肺军团菌株与其他23株菌分属于不同的克隆系。SBT方法的分型能力不及PFGE方法和AFLP方法。但SBT分型方法能够通过全球比对数据库得到更多的关于菌株遗传进化和流行分布的资料,在研究菌株分子流行病学及进化方面优于PFGE和AFLP方法。

采用ERIC-PCR与PFGE分析鲍曼不动杆菌基因型和同源性并对比方法学差异

目的比较脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)与肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERICPCR)检测鲍曼不动杆菌同源性的结果差异。方法分别采用PFGE和ERIC-PCR对我院院内分离的43株鲍曼不动杆菌进行分型检测。结果 43株鲍曼不动杆菌通过PFGE分型得出:A型22株、B型10株、C型3株、D型4株、E型2株、F型1株、G型1株;通过ERIC-PCR得出7种型别:Ⅰ型22株、Ⅱ型10株、Ⅲ型3株、Ⅳ型2株、V型3株、Ⅵ型1株、Ⅶ型2株。2种方法结果相符率为76.8%。我院鲍曼不动杆菌存在克隆株传播。结论 ERIC-PCR操作简便、结果可靠,与PFGE结果一致性高,2种分型方法均适合作为医院进行病原菌流行病学调查的分型检测手段。

德尔卑沙门菌PFGE分型探索

[目的]用脉冲凝胶电泳方法绘制德尔卑沙门菌的DNA指纹图谱,为研究德尔卑沙门菌的同源性提供分子生物学技术依据。[方法]从本实验室在各类食品中分离到的12株德尔卑沙门菌中提取DNA,经过限制性内切酶Xba1的切割,再用脉冲凝胶电泳仪进行DNA分子分型,并使用Quantity OneTM软件对其同源性进行分析比较。[结果]实验得到10株菌的DNA指纹图谱,与2003年D1号菌株遗传基因密切相关的菌株占22%;与2004年D15号菌株遗传基因密切相关的菌株占44%;2005年的4株菌中有3株之间的遗传基因密切相关;2006年的4株菌,分别为2株之间的遗传基因密切相关。[结论]脉冲凝胶电泳方法是分析引起食源性疾病的致病菌的同源性的有效方法。

南通市沙门菌PFGE分型分析及数据库的建立

目的:建立南通市沙门菌PFGE分型数据库,研究菌株间的同源关系,以便在发生沙门菌病时快速溯源,为控制该病的传播提供技术支撑。方法:从南通市分离到的5种52株沙门菌中提取DNA,用限制性内切酶XbaI进行酶切,在脉冲场凝胶电泳仪上进行DNA分子分型,应用沙门菌H9812作为PFGE的分子量标准。使用BioNumerics(Version4.0)分析软件,计算实验菌株相互之间的相似性关系。结果:52株沙门菌被分成4个PFGE型,分别命名为NTSpp1～4型,所有的埃森沙门菌、阿贡纳沙门菌、都柏林沙门菌都分别只有一个型,而德尔卑沙门菌则有4个型。菌株的来源(人和食品)不影响细菌的PFGE分型。NTSpp1和NTSpp2之间以及NTSpp3和NTSpp4之间的相似性分别为66%和74%,而NTSpp1和NTSpp2形成的簇和NTSpp3和NTSpp4之间形成的簇二者之间的相似性为63%。结论:南通市主要沙门菌的PFGE型别较多,呈现多样性。

2019—2020年桂林市食源性沙门菌耐药分析及PFGE分型研究

目的了解2019—2020年桂林市沙门菌耐药情况及分子分型特征,以期了解桂林市食源性沙门菌的流行变化规律。方法对2019—2020年食源性风险监测及突发公共卫生事件检出的69株沙门菌进行血清分型,根据CLSI 2020推荐标准,采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(MIC),分析耐药性,以脉冲场凝胶电泳法(PFGE)进行分子分型。结果69株沙门菌分属20个血清型,优势血清型为鼠伤寒沙门菌(27.54%)和肠炎沙门菌(14.49%);2019年的32株菌共产生17个耐药谱,其中9株鼠伤寒沙门菌对四环素100%耐药;2020年的37株菌共产生24个耐药谱,其中10株鼠伤寒沙门菌对磺胺异噁唑100%耐药。69株沙门菌呈现出多个不同的基因型别。相同血清型的基因型比较相近,具有同源性,不同血清型的PFGE结果具有多态性。结论2019—2020年桂林市沙门菌的优势菌株为肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌,检出的沙门菌存在耐药现象,不同沙门菌菌株之间可能具有亲缘性关系。

布鲁氏菌PFGE分子分型的条件优化

[目的]将PFGE方法应用于布鲁氏菌分型研究,探索建立布鲁氏菌PFGE分型的最优化方法。[方法]在用PFGE方法进行布鲁氏菌基因分型的研究中,针对不同内切酶、酶切的浓度和时间、脉冲时间等影响PFGE分型结果的因素进行优化,利用优化后的条件对布鲁氏菌19株标准菌株进行分型研究。[结果]在布鲁氏菌的PFGE分型研究中,选择XbaI为内切酶、酶切浓度为96u/200μl、酶切时间为4h、脉冲时间为2～25s为PFGE电泳的优化条件,在分析的19株布鲁氏菌标准菌株中,6种布菌的PFGE图谱各不相同,但PFGE不能将种内不同生物型布菌完全区分开来。[结论]PFGE方法可用于布鲁氏菌的基因分型的研究,是对传统分型方法一种较好的补充。

PFGE和质粒图谱分析人和猪来源德尔卑沙门菌多重耐药株的同源性

目的分析人和猪来源的德尔卑沙门菌的分子同源性，为研究多重耐药性在人畜之间传播提供分子生物学技术依据。方法药敏试验检测人和猪来源的德尔卑沙门菌多重耐药株对10种抗菌药物的敏感性；用脉冲凝胶电泳方法（PFGE）检测菌株间的分子同源性；结合实验或电转移试验获得目标质粒，质粒酶切图谱检测质粒的同源性。PCR分析染色体介导喹诺酮耐药基NgyrA~@arC，质粒可介导的喹诺酮耐药基因qnrA／qnrB／qnrC／qnrS、aac（6）-I b—cr、qepA和oqxAB。结果共收集48株德尔卑沙门菌，经药敏试验筛选获得11株多重耐药株（MDR），人源性8株，猪源性3株。11株菌除对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺和四环素（R型：ACSSuT）耐药外，所有菌株也对萘啶酸和环丙沙星耐药，6株对左氧氟沙星耐药，5株对头孢曲松耐药。PFGE分析，11株菌共分为6个克隆，3株动物源性菌株与8株人源性菌株无克隆相关性。喹诺酮耐药基因分析显示，有5株和3株动物源株检NNgyrA的Ser83Leu或／和Asp87Asn突变，6株人源株和3株动物源株检测到parC的Ser80Ile或／和Thr57Ser突变。质粒电泳分析显示，所有菌株都存在1．4条质粒条带，大小介于2～180kb，其中3株人源性菌株和l株动物源性株都存在4kb左右大小的质粒；2株动物源性菌株仅存在20kb大小质粒。用结合实验和电转移方法，分析4kb质粒结构，证实4个质粒的酶切图谱完全一致，质粒中均存在介导外排基NoqxAB~l喹诺酮耐药基因aac（6’）-Ib-cr。结论人和猪来源的德尔卑沙门菌多重耐药株中质粒介导的外排因oqxAB和诺酮耐药基因Naac（6）-Ib-c是喹诺酮重要的耐药机制，可能在沙门菌间传递，导致对喹诺酮类高耐药性。通过人和猪的接触或间接途径，沙门菌有传播喹诺酮耐药性的风险，同一种质粒可在人和动物中转移而传播该耐药机制。

2017年扬州市广陵区食品和公共场所从业人员沙门菌血清学及PFGE分型研究

目的探讨扬州市广陵区食品和公共场所从业人员沙门菌感染情况与血清型和分子分型特征。方法2017年采集食品和公共卫生服务行业从业人员肛拭子标本,进行肠道致病菌的分离培养,对分离株进行血清学分型,再以脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型和聚类分析。结果2017年共采集肛拭子标本22522份,检出沙门菌34株,检出率0.15%;男性0.10%,女性0.18%,差异无统计学意义(χ^2=2.15,P=0.14);夏秋季检出率(0.24%)高于冬春季(0.021%),差异有统计学意义(χ^2=16.9,P<0.01)。分离株以C1群最多(占35.29%),其次为B群(占32.35%);以里森沙门菌(占17.64%)和鼠伤寒沙门菌(占11.76%)为优势株。将血清凝集能分型的33株沙门菌进行PFGE分型分析,检出30个型别(P1~P30),其中3株为P29型、2株为P30型,上述5株相似度为85.42%,具有高度同源性;分离出的6株里森沙门菌中5株相似度相似度为60.56%,B群中的2株和E4群中的1株相似度为64.85%、C1群中的2株相似度为69.70%,均为相似菌株;其余型别相似度<50%,为流行病学不相关。结论2017年扬州市广陵区食品从业人员沙门氏血清型以C1群和B群为主。优势株为里森沙门菌、鼠伤寒沙门菌。菌株PFGE带型较分散。

院内多重耐药鲍曼不动杆菌分子流行病学和耐药性研究

目的分析院内临床和环境多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)的耐药机制和分子流行病学特征,为预防和控制MDRAB的传播提供依据。方法收集2020年5月至2021年4月院内临床及环境分离到的非重复MDRAB菌株34株,其中临床标本25株,环境标本9株。应用PCR和测序方法检测MDRAB的耐药基因。多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对MDRAB进行分子分型。结果34株MDRAB阳性基因携带率分别为:blaOXA23、blaOXA-51及blaOXA64gp均为100%,TEM 85.3%(29/34)。25株临床MDRAB监测到7个ST序列类型:分别为ST540(10/25)、ST195(5/25)、ST369(3/25)、ST208(2/25)、ST381(2/25)、ST938(2/25)和ST451(1/25);6个克隆群:分别为A群(9/25)、D群(8/25)、C群(4/25)、F群(2/25)、E群(1/25)、G群(1/25)。9株环境MDRAB监测到2个ST序列类型:ST208(8/9)、ST540(1/9);2个克隆群:B群(8/9)、C群(1/9)。结论院内MDRAB主要来源于重症监护病房,blaOXA-51-Like+blaOXA-23+blaTEM-like是主要碳青霉烯耐药模式。院内临床流行的主要序列类型为ST540和ST195,主要的克隆群为A群、D群。ST540、A克隆群MDRAB贯穿整个研究阶段且在多个重症监护病区播散流行。临床与环境MDRAB主要流行的ST序列型和克隆群存在差异。

潮州市临床沙门氏菌的耐药性和分子分型

为了研究引起潮州市临床患者腹泻沙门氏菌的血清型分布、耐药谱和分子分型特征,对2021年分离自广东省潮州市的定点监测医院腹泻患者的55株沙门氏菌,采用血清凝集法鉴定血清型、微量肉汤稀释法检测对17种抗生素的敏感性,脉冲场凝胶电泳对菌株进行分子分型.结果显示,在55株沙门氏菌中,主要的血清型为鼠伤寒沙门氏菌,占41.82%;其次是胥莱士亥姆沙门氏菌和瓦根尼亚沙门氏菌,均占10.91%.药物敏感性试验表明,菌株对氨苄西林/舒巴坦的耐药率最高,达80.00%;其次是四环素、氯霉素和复方新诺明,分别为76.36%、50.91%和49.09%.在55株沙门氏菌中,48株沙门氏菌经XbaⅠ内切酶处理后获得分子分型结果.它们共产生47个PFGE带型,呈现高度多态性,没有明显的优势PFGE带型.该研究结果提示引起腹泻的沙门氏菌血清型以鼠伤寒沙门氏菌为主.PAGE分子分型散在分布,表明潮州市沙门氏菌总体呈散发多态性,没有形成大规模的流行.值得关注的是,对抗生素耐药性及多重耐药性严重,应当引起重视并持续开展耐药及病原学监测.

呼吸机相关肺炎内源性感染途径的分子流行病学研究

目的 用分子流行病学方法研究呼吸机相关肺炎 (VAP)内源性感染途径在VAP发病机制中的作用 ,为探索和发展全新的VAP预防措施提供理论依据。方法 通过前瞻性队列研究 ,动态采集重症监护病房 (ICU)人工气道 (artificialairway ,AA)包括气管插管或气管切开患者胃腔、口咽部、下呼吸道标本行病原菌培养和药敏试验 ;筛选VAP患者中下呼吸道、胃液和 (或 )咽拭子标本中所分病原菌生化反应结果相同并有先后定植次序者 ;通过PFGE方法分析这些病原菌是否具有同源性。结果 98例人工气道机械通气患者中 5 2例发生VAP ;表型分析 5 2例VAP患者有 13例下呼吸道病原菌呈现胃腔→口咽部→下呼吸道的逆向定植次序 ;3例出现胃腔→下呼吸道的定植次序 ;病原菌的PFGE同源性分析表明ICU中 5 2例VAP患者有 15例 (其中 14例为晚发性VAP)存在胃腔→下呼吸道逆向内源性感染途径 ,占VAP发病总数的 2 8 8% ;PFGE技术方法为分析病原菌同源性的有效方法。结论 病原菌的PFGE同源性分析表明ICU中VAP患者存在胃腔→下呼吸道逆向内源性感染途径。

浙江省O157大肠杆菌监测及其分子生物学特性

目的了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7和其他O157大肠杆菌在浙江省动物、人群中的分布、流行以及PFGE分型、毒力基因携带状况。方法按全国O157∶H7监测方案在5-10月份肠道传染病高发季节,采集全省各地(市)肠道门诊腹泻病人粪便,进行O157大肠杆菌分离培养,并用免疫磁珠分离法对浙江省5个监测点的宿主动物进行O157∶H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O157∶H7抗原、志贺样毒素(stx1和stx2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,并将分析结果与本省首株患者粪便中分离的产志贺样毒素的O157∶H7菌株进行比较。结果全省5个监测点2006年共监测动物粪便标本2377份,分离到4株O157∶H7菌株,阳性率为0.17%;同时在绍兴、舟山肠道门诊腹泻病人粪便中分离到2株O157:H?菌株。4株O157∶H7菌株,stx2、Hly、eaeA均阳性,stx1均阴性;2株O157∶H?菌株仅1株携带eaeA毒力基因。脉冲场凝胶电泳分型显示,4株O157∶H7菌株分3个型,除金华地区2006年分离所得2株完全相似外,其它相同地区不同年代分离的O157∶H7菌株及相同年代不同地区分离的O157∶H7菌株则完全不相似。2株O157∶H?菌株1株PF-GE电泳条带降解,另1株与其它O157∶H7菌株电泳条带差异明显。结论浙江省大肠杆菌0157菌株在动物中以携带stx2毒力基因的O157∶H7菌株为主,但在腹泻患者中则以不带志贺样毒素的O157∶H?菌株为主。不同地区分离的O157∶H7菌株PFGE分型差异明显。羊、奶牛是携带stx2毒力基因的O157∶H7大肠杆菌的主要宿主。各级疾控应加强对宿主动物和腹泻病人大肠杆菌O157的分离监测和流行病学调查。

EGCG辐射保护作用的研究

采用MTT方法和脉冲场凝胶电泳方法 ,以人肝L0 2细胞株为研究对象 ,对没食子儿茶素没食子酸脂 (epigallocatechingallate ,EGCG)的辐射保护作用进行了研究。MTT结果表明 ,EGCG在 5— 5 0 μmol/L的浓度下 ,对细胞有明显的保护作用 ,并对细胞的修复有促进作用 ;脉冲场凝胶电泳方法结果显示 ,EGCG作用可减少辐射所致的DNA双链断裂水平。

2011至2012年石家庄地区沙门菌食物中毒分离株分子流行病学特征

研究沙门菌食物中毒分离株invA基因、血清型和基因型的分子流行病学特征。收集2011至2012年发生于石家庄地区6起食物中毒分离出的16株沙门菌,参照GB 4789.4-2010方法确定其血清型;用实时荧光PCR法检测分离株侵袭蛋白A(invA)基因;应用中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络(PulseNet China)推荐的脉冲场凝胶电泳技术对分离株进行基因型研究。16株沙门菌食物中毒分离株共分为5种血清型,分别为都柏林沙门菌2株、鼠伤寒沙门菌2株、肠炎沙门菌8株、圣保罗沙门菌3株、依麦克沙门菌1株;所有分离株invA基因均为阳性;血清型不同的分离株基因型也不相同,其中2起食物中毒分离株的基因型相同,相似性系数为100%,符合同一起暴发的一般规律。石家庄地区沙门菌食物中毒分离株致病性较强,某些血清型存在暴发的风险,应加强措施进行防范。

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分子流行病学研究

目的分析武汉两所医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)临床分离株产碳青霉烯酶的情况,以及分子流行病学特征。方法收集武汉两所医院2018年1-10月临床分离的42株非重复CRKP,采用CarbaNP试验方法对菌株产碳青霉烯酶情况进行初筛,聚合酶链反应(PCR)检测碳青霉烯酶基因携带情况,采用质粒接合试验分析耐药基因的水平转移情况,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行亲缘关系分析。结果42株CRKP菌株中14株CarbaNP试验阳性,其中有10株扩增出NDM-1基因,3株扩增出KPC-2基因。共13株CRKP碳青霉烯基因检测阳性,其中12株质粒接合试验成功。PFGE分析结果显示,携带NDM-1基因的CRKP菌株共分成6型,无明显优势型;携带KPC-2基因的CRKP菌株为同一型别。结论检出产NDM-1和KPC-2的CRKP菌株,质粒接合试验提示质粒介导的水平传播在碳青霉烯酶基因的播散过程中可能起重要作用。

不同宿主动物对小肠结肠炎耶尔森菌易感性研究

目的探讨宁夏地区不同宿主动物对小肠结肠炎耶尔森菌易感情况及不同来源分离菌遗传进化特征,为该菌防控提供依据。方法从采集的腹泻病例、猪、鼠类、羊和犬标本中分离小肠结肠炎耶尔森菌,并进行血清分型、生物分型及毒力基因检测,同时对O:3和O:9血清型菌株进行脉冲场凝胶电泳分析。结果 2874份猪标本检出147株菌,检出率5.11%;462份牛标本,检出5株菌,检出率为1.08%;2105份羊标本共检出20株菌;检出率为0.95%;腹泻患者检出2株,鸡检出7株,鼠检出14株,猫未检出,检出率为别为0.79%、0.65%、0.81%和0。猪主要感染致病性O:3血清型为主,生物型为2型;其他宿主动物检出均为非致病性O:5和O:8,生物型为1A。PFGE分为12种带型,K6GN11C30021、K6GN11C30012为主要型别,占所有分型菌株的(58/98)59.18%。结论猪的易感性最高,依然是宁夏地区小肠结肠炎耶尔森菌的主要宿主和传染源;人和猪对致病性菌株最为易感,其他宿主动物对非致病性菌株较为易感。

从北京某地分离的2株犬种布氏菌的鉴定报告

目的对从北京某地分离的2株布氏菌进行鉴定。方法布氏菌常规鉴定分型方法,布氏菌噬菌体裂解试验,同时辅以脉冲场电泳基因分型方法。结果2株待测菌株均为犬种布氏菌,2株待测菌的脉冲场电泳图谱与国际标准犬种布氏菌RM6/66株的图谱完全一致。结论采用传统布氏菌分型方法同时辅以脉冲场电泳基因分型方法对布氏菌进行分型鉴定,可以增加鉴定工作的稳定性与正确性。

杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型

目的研究杭州部分地区甲型副伤寒暴发与散发分离菌株的分子流行病学关系及菌株耐药状况。方法对2002-2005年杭州地区L县和X区5起暴发疫情和10起散发病例的分离菌株,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法进行分子分型,采用纸片法(K-B法)测定2种分离株的抗生素敏感性。结果分离自2个地区的15株菌株被分为A、B、C、D共4型,A、B、C等3个型密切近缘,同属一个克隆系。L县2005年7月和8月2起暴发菌株和8月3株散发菌株的PFGE型别均属B型,X区2004年12月和2005年9月的2起暴发菌株和9,10月的6株散发菌株的PFGE型别同属C型。4个型别的菌株对复方磺胺甲唑和利福平均100%耐药,对头孢唑啉、头孢曲松、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃唑酮均敏感,对氨苄西林、多西环素和四环素等不同程度耐药。结论除1株散发菌株外,2002-2005年分离自杭州L县和X区的甲型副伤寒病原菌属于同一克隆系。散发病例可能均属于暴发流行后的散发流行。