临床分离鸡毒支原体粘附素蛋白编码基因pvpA的分子特征

【目的】探讨中国临床分离鸡毒支原体粘附素蛋白(PvpA)编码基因pvpA的分子特征,为进一步了解鸡毒支原体致病机制、建立新的鉴别诊断方法奠定基础。【方法】利用巢式PCR法对41株广东、四川和北京地区临床分离的鸡毒支原体和3株参考株的pvpA基因进行扩增并测序,分析中国临床分离株pvpA的基因变异特征。【结果】所有临床分离株pvpA基因分子特征与强毒株S6,BG44T一致,与疫苗株F36完全不同。临床分离株pvpA基因C-末端DR-1、DR-2区域(第670位～第1056位)GC的含量为53.52%,明显高于鸡毒支原体的平均GC含量;所有临床分离株及S6、BG44T在DR-1和DR-2之间丢失60个碱基。推测该区域编码的氨基酸序列富含脯氨酸,高达30.27%;重复四肽Pro-Arg-Pro-X共出现10次,X为甲硫氨酸6次、甘氨酸1次、天冬酰胺1次、谷氨酰胺2次。而疫苗株F36PvpA只有DR-1区域,与R株相比间隔25肽缺失了24个肽,DR-2区域全部丢失。【结论】临床分离株pvpA基因变异特征与强毒株S6一致,与疫苗株F36的变异特征有显著差异,可以把pvpA基因作为靶标以建立临床鸡毒支原体流行病调查和诊断的新方法。

以重组PvpA蛋白作为抗原的鸡毒支原体抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鸡毒支原体(MG)种特异性检测的间接ELISA检测方法,本研究以原核表达的PvpA蛋白作为包被抗原,初步建立了检测MG抗体的间接ELISA检测方法。特异性试验结果表明,重组PvpA蛋白与鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、滑液支原体、大肠杆菌"O"抗原、禽沙门氏菌"O"抗原阳性血清均不发生交叉反应。该方法的批内变异系数小于8%,批间变异系数小于11%,表明具有较好的重复性。采用该检测方法与进口试剂盒对不同省份送检的鸡血清进行检测比较,两者阳性和阴性符合率均达到90%以上。本研究建立的间接ELISA检测方法为MG抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。