牛源化脓隐秘杆菌PLO蛋白的原核截短表达及其溶血活性检测

为研究牛源的化脓隐秘杆菌溶血素(PLO)生物学功能,本研究应用PCR方法扩增牛源化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)PLO全基因序列,通过生物信息学方法分析其与猪源A.pyogenes的PLO蛋白差异,并构建了溶血功能区重组表达质粒pQE30-PLO585,在E.coli XL1Blue中用IPTG诱导表达。结果表明,扩增到PLO蛋白基因ORF为1 605 bp,编码535个氨基酸,与猪源PLO的核苷酸序列同源性为97.4%,氨基酸同源性为97.2%,在生物学活性功能区没有发生改变。表达的PLO蛋白溶血功能区重组蛋白能够被阳性血清识别,而且具有溶解绵羊红细胞的活性,产生β溶血现象。本研究获得了牛源A.pyogenes截短重组PLO蛋白,并证明PLO具有β溶血功能与较好的抗原性。

牛源化脓隐秘杆菌溶血素的重组表达及其间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测牛源化脓隐秘杆菌抗体的间接ELISA检测方法,试验对分离的牛源化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因序列进行分析,截去信号肽与跨膜区域后进行碱基优化,合成PLO基因片段,连接至原核表达载体pET-30a中,转化至Arctic Express(DE3)大肠杆菌感受态后诱导表达并纯化,以纯化后的重组蛋白作为抗原包被96孔板,建立牛源化脓隐秘杆菌PLO抗体间接ELISA检测方法,确定检测方法的临界值、特异性、敏感性、重复性,并用建立的方法对临床血清样本进行检测。结果表明:成功构建了重组原核表达质粒pET30a-PLO,实现了重组蛋白在Arctic Express(DE3)大肠杆菌感受态中的表达,并建立了用于检测牛源化脓隐秘杆菌PLO抗体的间接ELISA检测方法。该检测方法的临界值为0.354,与常见牛细菌阳性血清无交叉反应,阳性血清稀释至320倍检测仍高于临界值;批内、批间检测变异系数均小于5%;对10份已知阳性血清进行检测,阳性检出率为100%,80份临床牛血清的阳性检出率为21.25%(17/80)。说明该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可用于牛源化脓隐秘杆菌感染的快速检测与流行病学调查。

化脓隐秘杆菌溶血素和铁结合蛋白的抗体应答分析

目的对化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)溶血素(pyolysin,PLO)和铁结合蛋白(iron-binding protein,IBP)的抗体应答情况进行分析。方法采用腹腔注射途径建立化脓隐秘杆菌小鼠感染模型,观察不同剂量细菌对小鼠的致死性和注射部位形成的组织病变。制备化脓隐秘杆菌灭活抗原,采用肌肉注射途径免疫45只雌性昆明小鼠和10只山羊,每只小鼠0.2 mL,每只山羊1 mL,均进行3次免疫,每次间隔2周,第3次免疫后2周采血分离血清。采用ELISA法测定感染小鼠、健康圈养羔羊、化脓隐秘杆菌灭活抗原免疫小鼠和山羊血清中抗PLO和IBP的IgG抗体水平。结果注射部位出现化脓和皮肤坏死的小鼠血清中能检出高水平的抗PLO和IBP抗体;无组织病变小鼠血清中仅能检测到低水平的抗IBP抗体;连续注射无组织病变剂量细菌的小鼠血清能检出抗PLO和IBP抗体。圈养羔羊血清抗PLO抗体阳性率高,而抗体水平低。免疫小鼠和山羊血清中均能检出抗IBP抗体,但部分动物检测不出抗PLO抗体。结论IBP是化脓隐秘杆菌感染和灭活疫苗免疫诱导抗体应答的主要抗原之一,PLO抗体水平具有反映感染所造成的组织损伤与灭活疫苗免疫效果的潜力。