硝吡咯菌素菌种选育

目的把一种新的方法应用于提高硝吡咯菌素工业生产菌株的生产能力。方法在硝吡咯假单胞菌中引入氨基糖苷类抗生素抗性突变 ,以提高硝吡咯菌素的生产能力。结果从含 3倍和 1 0倍MIC抗生素的GYM筛选平板上挑取抗性突变株 ,挑选出产抗能力提高 5倍以及 1 0倍以上的突变株 ;引入链霉素抗性突变对提高硝砒咯菌素的生产能力的效果最佳 ;Geniticin和庆大霉素的抗性突变对提高抗生素生产能力的效果较差 ;潮霉素抗性突变对提高抗生素生产能力具有一定的效果。结论引入氨基糖苷类抗生素抗性突变 ,可以有效提高硝吡咯菌的生产能力。

伯克霍尔德氏菌JP2-270抗水稻纹枯病菌机理的初步研究

水稻纹枯病是由立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的,是水稻的三大病害之一。本研究采用基因敲除、荧光定量PCR和靶向代谢物差异分析等方法,初步探索了伯克霍尔德氏菌Burkholderiasp.JP2-270抑制水稻纹枯病菌的作用机制。首先,选取了水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryza、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum、番茄斑枯病菌Septoria lycopersici Speg.、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum和烟草枯萎病菌Fusarium oxysporum等病原真菌进行抗真菌活性测定,结果表明,菌株JP2-270具有广谱抗真菌活性。其次,通过靶向基因敲除明确了菌株JP2-270所产生的硝吡咯菌素pyrrolnitrin是抑制立枯丝核菌GD118的主要次生代谢物。最后,qRT-PCR分析表明硝吡咯菌素的合成在转录水平上受到菌株JP2-270中Lys R家族转录调控蛋白Bys R的正向调控;并且,差异代谢物谱分析也证明Bys R能够正调控硝吡咯菌素的合成。在伯克霍尔德氏菌中Lys R类型的转录调控蛋白Bys R作为硝吡咯菌素合成调控的研究属于首次报道,Bys R蛋白可作为基因工程的靶点,通过遗传改良提高硝吡咯菌素的生物合成量。因此,菌株JP2-270具有开发成生物防治剂防治植物真菌病害的潜能。

普城沙雷氏菌硝吡咯菌素prnA基因突变株的构建

普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)G3是小麦内生菌,通过合成硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin,PRN)抑制植物病原菌。PRN是色氨酸衍生物,通过抑制病原菌呼吸链电子传递系统而具有抗生作用。已报道在假单胞菌和布氏杆菌属中PRN生物合成由prnABCD操纵子控制,需要4个酶PrnA-D顺序作用。而在沙雷氏菌中PRN生物合成还较少有研究。通过基因替换、同源重组策略,构建了G3菌株prnA基因缺失突变体。研究结果表明△prnA突变体不能合成PRN,同时也丧失了对板栗疫病菌Cryphonectria parasitica的拮抗活性,证明prnA基因也是S.plymuthica合成PRN所必需的;也为进一步鉴定抗生素PRN的生物学功能奠定了基础。

防御假单胞菌H78中crp基因对抗生素合成的调控作用

crp基因(编码cAMP受体蛋白)作为全局调控因子广泛存在于各种细菌中,在不同菌株中表现不同的调控功能。防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)H78能产生硝吡咯菌素(Prn)、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)和藤黄绿菌素(Plt)等多种广谱抗生素。为探究P.protegens H78中crp基因对抗生素Prn、2,4-DAPG和Plt合成的调控作用,利用基因无痕敲除、HPLC分析、lacZ报告基因分析等技术,分析crp基因对抗生素Prn、2,4-DAPG和Plt合成及基因表达的影响。结果表明:H78菌株中crp基因的敲除导致Prn合成操纵子prnABCD表达显著下降;Plt合成及操纵子表达显著上升;2,4-DAPG合成及操纵子表达小幅下降。因此,P.protegens H78中crp基因对抗生素Prn合成存在显著的正调控作用,而对Plt合成存在明显的负调控作用,对2,4-DAPG合成存在一定的正调控作用。

桃褐腐病生防细菌FD6硝吡咯菌素合成基因簇的克隆及prnA功能分析

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)FD6分离自福建闽侯青口青菜根围土壤,采用凹玻片法和离体果实接种法测定菌株FD6对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑制能力。PCR法克隆硝吡咯菌素合成基因簇结构基因(prn),利用同源重组构建prn A缺失突变体并分析其功能。结果表明,菌株FD6处理桃后可完全抑制桃褐腐病发生;细菌悬浮液对褐腐病菌分生孢子的萌发抑制率达93.18%,细菌培养滤液的抑制率为69.36%;细菌悬浮液对黄瓜根结线虫也具有较强的致死作用。序列分析表明荧光假单胞菌FD6硝吡咯菌素合成基因簇全长为5 868 bp,内含4个开放阅读框prn A、prn B、prnC和prn D,这4个基因组成1个共转录单元。系统发育进化树显示菌株FD6与P.protegens CHA0、Pf-5的prn基因相似性达94%。利用遗传学方法证实prn A基因是硝吡咯菌素合成的必需因子,此外该基因还影响2,4–二乙酰基间苯三酚和藤黄绿脓菌素的合成。

生防细菌L5生防相关因子的初步分析及其种类鉴定

从扬州郊区土壤中分离到细菌菌株L5,该菌株抑菌谱广,对多种病原真菌都有明显的拮抗能力,离体叶片生物测定结果表明菌株L5对番茄灰霉病防效达72%。对该菌株的生防相关性状进行分析,结果表明菌株L5可产生硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin)和嗜铁素等抗菌物质。经过16S rDNA序列、16S-23S rDNA间区序列同源性分析和生理生化性状的测定,将该菌株鉴定为气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)。细菌菌株L5包含2个16S-23S rDNA的间区(IGSs),其中IGS1内含tRNAGlu基因,间区类型属于IGSG;IGS2内含tRNAIle和tRNAAla基因,间区类型属于IGSIA。