福建省不同地理株白纹伊蚊rDNA ITS2基因多态性分析

目的探讨福建省不同地理环境白纹伊蚊rDNA ITS2基因序列特征。方法在闽东福鼎市、闽北武夷山市、闽中涵江区和闽南东山县分别现场采集5个点的白纹伊蚊幼虫,实验室饲养,收集羽化成蚊,用75%酒精-20℃保存,PCR特异扩增白纹伊蚊rDNAITS2,用生物信息系统进行白纹伊蚊rDNAITS2基因多态性的分析。结果 PCR特异扩增福建省4个不同地理环境白纹伊蚊rDNA ITS2,在琼脂凝胶电泳上获得500bp左右的扩增片段。序列分析福建不同地理环境的白纹伊蚊在rDNA ITS2表现了基因的多态性,其rDNA ITS2基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失,而同一地理环境的5只白纹伊蚊rDNA ITS2基因序列没有差异。结论福建省不同地理区域的白纹伊蚊在rDNA ITS2区表现的遗传多态性,可能与蚊虫生态环境如海拔高度、气温、降雨量和湿度等有一定的关系。

深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2区克隆及SNP分析

目的克隆和序列分析深圳市白纹伊蚊核糖体DNA(rDNA)第2内转录间隔区(ITS2),并探明其rDNA ITS2核酸的特异性及不同个体在rDNA ITS2区的单核甘酸的多态性(Single Nuclear Polymorphism,SNP),以便利用ITS2基因的高度保守性及其蚊媒不种群在ITS2片段的多态性来分子鉴别白纹伊蚊。方法PCR特异扩增白纹伊蚊rDNA ITS2,利用QIAquick技术从琼脂糖胶上回收纯化扩增的目的ITS2 DNA片段,纯化后的目的ITS2 DNA片段被连接到TA载体上,在含有青霉素的琼脂糖胶平面上筛选含目的ITS2 DNA片段的阳性克隆,阳性克隆经含有青霉素的LB液体培养基培养,用Ultrapure^(TM)质粒提取试剂盒提取克隆质粒,用双酶切鉴定插入的片段大小,DNA序列分析仪分析每个蚊rDNA ITS2的序列,用生物信息系统进行白纹伊蚊rDNA ITS2 SNP的差异分析。结果518bp全长的深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2被克隆和序列分析,深圳市四个不同地理的白纹伊蚊rDNA ITS2的同一性为97％,而两个地方之间的比较有99％的同一性,其rDNA ITS2基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失,在518bp的范围内有6个C→T,2个A→G的转换,3A→T,一个A→C的颠换,3个CG和一个AC缺失。结论白纹伊蚊rDNA ITS2有高度的保守性,不同个体也表现了单核苷酸的多态性。

rDNA ITS2区段基因序列分析技术用于江苏省疟疾疫情不稳定地区传疟媒介的鉴定

目的了解江苏省近年来疟疾疫情回升地区媒介按蚊种类。方法采用rDNA ITS2区段基因序列分析技术,对半通宵室外人饵诱捕法和清晨蚊帐内捕蚊法捕获的现场按蚊进行蚊种鉴定。结果经形态学鉴定和PCR基因扩增,并与实验室模式种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊DNA基因比较,现场捕获的按蚊均为中华按蚊。结论中华按蚊仍是目前江苏省疟疾疫情回升地区的主要传疟媒介。

松材线虫rDNA-ITS2的Taq Man探针实时荧光PCR检测

以松材线虫rDNA -ITS2为靶区 ,建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明 ,探针检测松材线虫和拟松材线虫时 ,前者产生明显的荧光信号 ,后者无荧光信号 ,表明探针具有高度的特异性 ;探针检测到最低模板浓度为 1pg·μL- 1 。

淡色库蚊rDNA-ITS2基因的克隆分析

目的克隆并鉴定淡色库蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因并应用于现场孽生蚊媒的种属鉴定,从而为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据。方法设计淡色库蚊诊断性引物分别对淡色库蚊实验室标准株及从现场采集的蚊虫的rDNA-ITS2序列进行PCR扩增,PCR产物纯化后连接到pGEM-Teasy载体上并转化到DH5α菌中,然后对其进行DNA序列测定及分析。结果成功克隆了淡色库蚊的rDNA-ITS2基因。序列分析结果表明,实验中所克隆到的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列与GenBank所登录的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列同源性均为98%以上,同时发现孽生现场存在淡色库蚊。结论rDNA-ITS2序列在淡色库蚊中具有种属特异性,可为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据。

微小按蚊复合体rDNA-ITS2序列差异及遗传多态性研究

本研究对我国微小按蚊广西、云南、海南 6个地理株和越南Caonguen株rDNA ITS2PCR扩增片段和序列差异作分析 ,获得基因片段总长为 5 6 1bp～ 5 6 3bp ,发现地理株间ITS2序列差异程度不同 ,分析表明元江株为微小按蚊C型 ;其余 6个地理株为A型。应用限制性内切酶Sau96Ⅰ对微小按蚊复合体rDNA ITS2PCR扩增片段作酶切分型 ,结果同样显示两型差异 。

我国4省区5地牛带绦虫rDNA-ITS2序列分析

目的采用PCR克隆测序方法对贵州都匀、从江,云南大理及新疆乌什4地牛带绦虫标本进行研究,与台湾桃园牛带绦虫亚洲亚种地理株作比较,为贵州株、云南株和新疆株的鉴别提供分子生物学证据,并进一步探讨牛带绦虫亚洲亚种的分类学地位。方法取贵州都匀株(DY1)、贵州从江株(CJ1),云南大理株(DL1),新疆乌什株(XJ1)和台湾桃园株(TW1)成虫节片,分别抽提DNA,PCR扩增rDNA-ITS2区段,克隆rDNA-ITS2区段后作序列分析,构建不同地理株系统发育树。结果根据ITS2序列构建的系统发育树显示:系统发育树分为3支,XJ1占据上方1支;CJ1占据中间1支;而TW1、DY1和DL1组成下方1支。结论1.DY1、DL1与TW1属于牛带绦虫亚洲亚种,CJ1、XJ1属于传统牛带绦虫;2.rDNA-ITS2序列分析可用于牛带绦虫亚洲亚种与传统带绦虫分类学之研究。

基于rDNA-ITS2序列的中国按蚊属塞蚊亚属部分种类的系统发育研究(双翅目:蚊科)

应用rDNA-ITS2序列,采用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML),以按蚊亚属Anopheles的中华按蚊An.(An.)sinensis和赫坎按蚊An.(An.)hyrcanus为外群,对采自中国的按蚊属Anopheles塞蚊亚属Cellia21种蚊进行了系统发育分析。结果表明:rDNA-ITS2序列的长度范围为435～838bp,塞蚊亚属蚊种间遗传距离为0.027～0.496,平均值为0.336。各种方法重建的系统发育树均显示新迈蚊系Neomyzomyia为单系,新塞蚊系Neocellia和迈蚊系Myzomyia为并系。21种蚊在系统发育树中均分为4支,伪威氏按蚊An.pseudowillmori和塞沃按蚊An.sawadwongporni未归入多斑按蚊种团(An.maculatus group),其它各种团和复合体成员种的聚类关系与形态分类结果一致。本研究重建的分子系统发育树阐明了中国按蚊属塞蚊亚属各系及蚊种之间的亲缘关系,ITS2序列具有足够的信息贡献量。

基于rDNA ITS1和ITS2序列的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的分子鉴定

本研究测定了褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera和灰飞虱Laodelphaxstriatellus的rDNA ITS1和ITS2的序列,以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法。3种飞虱的ITS1和ITS2侧翼区(18S,5.8S和28S)序列相对稳定,但ITS1和ITS2序列在3种飞虱中变异较大。ITS1在所分析的438个位点中可变位点达294个,ITS2在分析的403个位点中可变位点为177个。根据3种飞虱rDNA的ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,分析发现3种飞虱ITS1区的特异性引物扩增效果不理想,而ITS2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带。因此,采用ITS2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定。

我国赫坎按蚊复合体成员种的rDNA-ITS2区序列差异及系统发育分析

测定了我国赫坎按蚊复合体 9成员种的核糖体DNA第二内转录间隔区 (rDNA ITS2 )序列 ,根据序列差异分析各蚊种间的系统发育关系。结果显示 :( 1 )ITS2区序列最长的是中华按蚊 ( 4 6 8bp) ,最短的是克劳按蚊和赫坎按蚊 ( 4 36bp) ;GC含量为 4 4 9%～ 4 6 8% ;( 2 )发现该复合体 4成员种的ITS2区序列存在种内个体间差异 ,幅度为 0～ 3 8% ,明显小于种间差异 ;( 3)将各蚊种的ITS2区序列进行同源排序比较 ,发现其变异大多是简单重复单元的拷贝数不同 ;种间差异性最大的是克劳按蚊与嗜人按蚊( 32 3% ) ,最小的是贵阳按蚊与凉山按蚊 ( 9 0 % )平均差异率为 2 2 3% ;( 4 )根据ITS2区序列特征 ,用 3种方法构建的树状图拟合一致。以上结果表明赫坎按蚊复合体各成员种rDNA ITS2序列在种内非常保守 ,以种间序列差异分析为基础的分子鉴别技术是甄别蚊种分类地位混淆和错误的有效方法。

日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的rDNA-ITS2遗传多态性研究

目的分析日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因的遗传变异。方法采集2种吸虫成虫标本,提取其基因组DNA,PCR特异性扩增rDNA-ITS2基因并测序;Clusterx软件进行多序列对比;MEGA4软件计算遗传距离,NJ法和MP法构建系统进化树;DNAsis软件对rDNA-ITS2序列片段进行模序分析。结果2种方法构建的遗传系统进化树基本结构相似,日本血吸虫与斯氏并殖吸虫间存在较远的遗传距离,但二吸虫ITS2序列间有42.7%的相似性。利用DNAsis软件在日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的rDNA-ITS2序列中发现AP_2_CS6、bHLH_CS和CAP_site3种相同的转录因子。结论日本血吸虫和斯氏并殖吸虫虽然在rDNA-ITS2基因水平上存在明显种间差异,但在rDNA-ITS2序列、转录因子方面具有重要的相似性。

应用rDNA-ITS2诊断性序列现场对3种重要蚊媒的鉴定

目的建立利用核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)诊断性序列鉴别蚊媒的分子生物学方法。方法根据淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊rDNA-ITS2基因两侧的5.8S和28S保守区设计诊断性引物,进行3种蚊虫的rDNA-ITS2克隆鉴定,并利用其rDNA-ITS2特征进行现场蚊虫的鉴别。结果诊断性引物对于淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊DNA模板的扩增产物分别为440、514和558bp,3种蚊虫阳性克隆的测序结果与GenBank-blast相应蚊种rDNA-ITS2序列的同源性均为99%。用Biosept、DNAstar等软件分别分析发现各蚊虫克隆的个体间存在一定程度的单核苷酸多态性(SNP)。将现场采集的蚊虫诊断性引物扩增产物进行阳性克隆进行序列测定和分析,显示与淡色库蚊阳性对照的一致性为99%;与GenBank中淡色库蚊rDNA-ITS2基因的同源性为99%。结论通过对淡色库蚊、白纹伊蚊、嗜人按蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因的序列分析,表明3种蚊媒的rDNA-ITS2基因具有可鉴别的种属特异性。利用同一体系的共享引物扩增,可以建立适用于3种蚊媒的现场鉴定方法。

不同地区不同生境按蚊种群的分子鉴定及rDNA-ITS2序列分析

对采自安徽、江苏、湖南、广西、云南及海南等地区的人房、牛棚、稻田、山区等不同生境的按蚊，按照文献合成引物，用PCR方法进行分子鉴定；并对各种群的ITS2序列测序后，与GenBank所得赫坎按蚊复合体近缘种群按蚊的ITS2序列进行比对分析。结果显示，采集的不同地区不同生境的按蚊均为中华按蚊，此次采集没有采到嗜人按蚊；现场的中华按蚊与凉山按蚊、贵阳按蚊和昆明按蚊的同源性为80．6％～83．1％．与嗜人按蚊和雷氏按蚊的同源性为75．2％～76．2％，与最黑按蚊和带足按蚊的同源性稍低，为63．2％～64．6％。系统发育树显示：所有的序列样本形成了两个分支，来自现场的按蚊处在同一分支且差异小。

中国7市家蝇rDNA-ITS2基因分析

目的：分析我国7市家蝇的rDNA-ITS2基因.方法：采集北京、吉林、长春、成都、南京、湖北荆州和养殖7市8个家蝇样本,形态鉴定.依据Drosophila melanogaster的nrRNA序列,设计扩增不同地区家蝇rDNA-ITS2基因的引物,PCR扩增不同地区家蝇基因组,获特定基因片段,SSCP分析.将PCR扩增不同地区家蝇rDNA-ITS2片段克隆于pMD-18T载体,序列测定,采用ClustalW软件在线分析不同地区家蝇rDNA-ITS2序列,用MegAlign（4.0）软件的UPMGA方法构建系统发育树.结果：我国7市8个家蝇样品的rDNA-ITS2基因均获约360bp阳性扩增区带.SSCP分析8个家蝇样品的rDNA-ITS2的SSCP电泳DNA迁移率均有一定差异.ClustalW比对分析不同地区的8个家蝇rDNA-ITS2基因序列间存在一定差异.同源性为75%,而其中部分地区家蝇样品rDNA-ITS2序列同源性高,家蝇（长春、吉林、养殖）,三者之间的同源性为98.0%~99.1%;家蝇（成都、南京、广州、荆州）之间的同源性为99.1%~99.7%.系统聚类分析显示,发育树共分成2支,1支是家蝇（北京与养殖）关系密切,先聚为一类,然后与家蝇（长春）再聚类;另1支是家蝇（成都与荆州）关系密切,最先聚类,然后与家蝇（南京）聚类,再与家蝇（广州）聚类,最后与家蝇（吉林）聚类.结论：应用PCR-SSCP和rDNA-ITS2基因序列分析揭示我国不同地区家蝇基因组序列存在一定差异.

赤眼蜂rDNA-ITS2克隆测序及蜂种特异引物设计

通过对松毛虫赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂 ITS2基因 (内部可转录间隔区 )的克隆测序 ,并联机检索 Gen Bank核酸序列库中其它相关序列 ,我们利用引物设计软件 Primer Premier 5 .0设计出蜂种的特异引物 ,对赤眼蜂各个发育期 ,包括卵期、幼期和成熟期进行检测 ,实现了松毛虫赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂快速、可靠的分子鉴定和检测。该技术可用于赤眼蜂的田间种群监测。

嗜人按蚊rDNA-ITS2基因的克隆鉴定及SNP分析

目的克隆和分析嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)第2内转录间隔区(ITS2)序列,研究嗜人按蚊rDNA-ITS2序列的种属特异性及不同个体rDNA-ITS2序列的单核苷酸多态性(Single Nuclear Polymorphism,SNP)。方法用DNA提取试剂盒从嗜人按蚊中提取DNA摸板,利用蚊虫5.8S和28S序列的保守性设计特异引物进行聚合酶链反应以扩增嗜人按蚊rDNA-ITS2基因,扩增产物经回收纯化后连接到TA载体,经amp+LB固体平板筛选的阳性克隆,经amp+LB液体培养基培养后进行PCR鉴定、EcoRI酶切鉴定和序列分析。结果经PCR反应扩增出全长556bp的嗜人按蚊rDNA-ITS2基因,纯化后重组克隆经PCR鉴定可重现556bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同。嗜人按蚊6个克隆的同一性为99.6%,其rDNA-ITS2基因单核苷酸存在颠换和插入,在556的范围内有一个A→T,一个G→T的颠换;一个T的插入。结论嗜人按蚊rDNA-ITS2序列在种间高度保守,但不同个体间也存在一定的SNP多态性。

云南洱海环湖带绦虫rDNA-ITS2序列测定及分析

目的:对云南洱海环湖地区的带绦虫标本的rDNA-ITS2区段序列进行测定,确定亚洲带绦虫在洱海环湖地区的分布情况,进一步探讨亚洲带绦虫的分类地位.方法:取大理挖色、洱源、喜洲、周城、双廊、贵州都匀、贵州从江和传统牛带绦虫成虫标本,分别提取DNA,PCR扩增rDNA-ITS2片段后做序列测定及分析,并构建系统进化树.结果:根据ITS2测序结果构建系统进化树显示,树共分为两大枝,洱源、挖色和从江标本为第1枝,周城、喜洲、双廊和都匀为第2枝.结论:洱源与挖色存在传统牛带绦虫,周城、喜洲和双廊存在亚洲带绦虫.传统牛带绦虫和亚洲带绦虫在大理地区有分布区域上的重叠性.

rDNA-ITS2序列作为中国按蚊分子鉴别特征的评述：Ⅱ塞蚊亚属

为评价核糖体DNA第2内转录间隔区（ rDNA-ITS2）序列作为中国按蚊属塞蚊亚属蚊种鉴别的分子特征。笔者整理和分析了数据库中注册的所有中国记录的塞蚊亚属蚊种的rDNA-ITS2序列，并应用MEGA软件计算其在种内和种间的差异性（ p距离）。截止2013年7月， GenBank中已注册ITS2序列共442条，隶属塞蚊亚属蚊27种。计算结果显示， ITS2序列在大多数种内的变异性小于1％；而注册的浅色按蚊、乌头按蚊和溪流按蚊的序列种内差异较大，无法确定其种特异序列；忽略上述3蚊种进行计算的其他种间序列差异性范围为2.80％（大劣按蚊与大劣按蚊D）～68.3％（多斑按蚊与迷走按蚊）。结果提示rDNA-ITS2序列在中国塞蚊亚属大多数蚊种中具有良好的种内保守性和种间解析度，少数种类无法区分。

新疆6种蚊虫的rDNA-ITS2区序列分析

测定并分析了新疆 ４种伊蚊和 ２种按蚊的 ｒＤＮＡ—ＩＴＳ２区序列，新疆伊蚊、刺扰伊蚊ＩＴＳ２区长度分别为 ２３１ｂｐ～２５６ ｂｐ、２５０ｂｐ或 ２５３ｂｐ，其克隆间、种内序列差异分别为 ０．３％～４．３％、０．８％～１．４％；里梅伊蚊与长刀伊蚊的长度为３３０ ｂｐ、２５１ ｂｐ，种内序列无差异；４种伊蚊种间序列差异明显大于种内差异水平，为１２．３％～３３．５％；赫坎按蚊和米赛按蚊的 ＩＴＳ２区序列长度分别为 ４６３ｂｐ、３１１ｂｐ，种内个体间无差异，而种间的差异为 ３０．８％．结果显示 ｒＤＮＡ－ＩＴＳ２区序列差异，为形态上易混淆蚊种提供了有意义的分子鉴别特征。

两种细蚤rDNA—ITS2序列的研究

本文首次测定和分析缓慢细蚤Leptopsylla segnis（Schonherr，1811）和距细蚤Leptopsylla lauta （Rothschild，1913）的rDNA—ITS2序列，为蚤的分类和系统发育研究提供有意义的基础资料。通过聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增缓慢细蚤L．segnis和距细蚤L．lauta各3个个体的rDNA．ITS2序列，并对扩增产物进行PCR直接测序和分析。结果显示，缓慢细蚤和距细蚤的rDNA．ITS2序列的长度均为309bp；缓慢细蚤序列的CG含量为50．9％～52．1％；距细蚤序列的CG含量为49．5％～50．6％。缓慢细蚤与距细蚤的rDNA—ITS2序列有16个碱基不同，其中7个是颠换，9个为转换，两种细蚤之间有一定差异。