运用均匀设计法优化rPA(K)在原核系统中的表达条件

运用均匀设计法对影响rPA(K)在大肠杆菌中表达的因素进行了优化设计,摸索出了对表达产物进行诱导表达的最佳优化表达条件。结果如下:溶解氧为90%,IPTG诱导时间为5.3h、IPTG终浓度为0.1mmol/L、培养基为HD、pH值为6.0、诱导温度为25℃。目的蛋白平均密度从0.16提高到0.48,是优化前的3倍。

rPA(K)原核表达产物的复性与纯化

为探索新型rPA(K)在原核系统中表达产物的纯化和复性,采用不同的洗涤剂(脲、Triton X-100、乙醇)依次洗涤包涵体,又经硫酸铵沉淀,得到了经初纯后纯度较高的包涵体.结果表明,经2 mol/L脲1、mL/L TritonX-100、200 mL/L乙醇洗涤,15%饱和度的硫酸铵沉淀后,包涵体的纯度由16.0%提高到56.6%.在此基础上,利用稀释复性和透析复性2种方法对包涵体进行复性,以恢复产物的天然构象,获得具有生物学活性的目的蛋白.结果如下:采用透析复性法,rPA(K)的比活可达1.33×105IU/mg;采用稀释复性法,rPA(K)的比活可达1.06×105IU/mg.利用S.TagTMrEK纯化试剂盒对目的产物进行进一步纯化,并对rEK和MgCl22种洗脱剂的洗脱效果进行了比较.SDS-PAGE结果显示,MgCl2洗脱后的产物,分子量未发生变化,仍为43 ku,其纯度为72%;而rEK洗脱后的产物,其纯度达到了72%,且分子量减小至约40 ku,表明去除了融合蛋白中的非目的片段.

新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达

利用PCR技术,获得了rPA(K)cDNA片段,将其克隆至pET-30a(+),成功构建了新型的rPA(K)原核载体pLrA(K),并实现了其在大肠杆菌中的初步表达,经IPTG(终浓度为1 mmol/L)分别于37℃诱导1,2,3 h后,以Bio-Rad凝胶成像仪分析目的蛋白,相对含量分别是19%,15.8%和24.3%,平均密度分别是0.13,0.14和0.16,IPTG诱导3 h后蛋白表达量最高.ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为210μg/L.

rPA(K)的原核表达及其产物的初步纯化

rPA(K)是经过缺失/定点突变技术所获得的t-PA突变体。本实验以IPTG诱导,实现了rPA(K)在原核系统中的表达。实验证明目的产物的表达形式为包涵体,且当以IPTG诱导3h时,表达量最高,为41%。此后对该表达产物进行了初步纯化,即通过对不同超声破碎次数,包涵体洗涤液(脲,Triton X-100,乙醇)的不同浓度对纯化的影响因素进行了摸索。结果表明,超声2次,2M脲,0.5%Triton X-100,20%乙醇对目的蛋白纯化的效果最好,从而为进一步的纯化和复性奠定基础。

Reteplase(K)原核分泌表达载体的构建及其初步表达

在原核表达载体pErA(K)的基础上,构建新型原核分泌表达载体pBrA(K),并实现其在原核表达系统中的表达。用限制性内切酶NcoI,XhoⅠ同时双酶切获得目的基因rPA(K)后,以T4连接酶将其连接到pET-20b(+)上,构建新型原核分泌表达载体pBrA(K)并实现了在大肠杆菌中表达,经纤维蛋白平板检测存在于重组菌株培养液上清中的分泌蛋白有溶纤活性。ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为51 ng/mL。实验结果证明新型原核分泌表达载体pBrA(K)构建成功,并实现了其在原核表达系统中的表达,为新型rPA(K)的表达优化及后续的纯化研究工作奠定了基础。

RPA财务机器人在企业财务共享中心的应用研究

以大数据智能化为切入视角,基于K-means和C4.5决策树算法,构建了融合RPA的财务共享中心运营管理优化模型。结果显示,在绩效评价优化层面,聚类-1下绩效评价频率高且在90%以上,而聚类-2下频率相对较低且在70%~90%之间;在风险管控优化层面,训练数据集的预测准确率高达91.24%,而测试数据集的预测准确率达到74.16%;而在税务管理层面,优化后模型的AUC、CA以及Recall等性能指标均得到显著提高。结合K-means和C4.5决策树大数据智能算法构建的融合RPA的财务共享中心运营管理优化模型,既降低了财务共享中心运营管理成本,又充实了财务运营管理技术体系,继而全面提高了企业财务运营管理质量与水平。

K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h左右可对ALV-K进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。

CHO工程细胞株低血清培养的初探

以DMEM∶F12(1∶1)为基础培养基,对CHO细胞的低血清培养进行了初步探索,降低培养基中血清含量,观察了细胞在10%、5%和1%等不同浓度低血清培养条件下生长状态和外源蛋白表达活性的变化。试验结果表明:在含1%血清的F12∶DMEM(1∶1)培养基中,细胞仍能保持良好的生长状态,且培养上清中的目的蛋白活性与常规血清浓度10%DMEM培养条件下的活性接近。从而达到了既可以降低生产成本,又可以降低纯化难度的目的。