新型番鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其抗原特性

新型番鸭呼肠孤病毒是近年来新发现的一种引起鸭严重疾病的病原,该病毒与经典MDRV主要在病毒宿主范围、体外培养特性、临床致病性和免疫保护特性上存在显著的差异。通过RT-PCR扩增新型呼肠孤病毒σC基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理,插入到p ET-28a(+)原核表达载体,获得重组质粒p ET-28a(+)-σC。将重组阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达后经SDS-PAGE电泳对σC蛋白进行初步分析,蛋白分子量约为36 k Da。重组蛋白经纯化后免疫实验兔,获得抗σC蛋白的高效免疫血清。通过Western Blot与间接免疫荧光实验初步表明,新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白具有良好的反应活性。

磁性免疫微球在人血清白蛋白纯化中的应用(英文)

目的为了快速地从人血清中提纯人血清白蛋白,利用磁性免疫微球作为提取手段,再用间接酶联免疫法测定人血清白蛋白的回收率。方法将经过羧基修饰的聚苯乙烯微球作为载体,用EDC(碳化亚胺)活化微球表面的羧基,再将兔抗人血清白蛋白抗体包被于微球上,这种微球-抗体复合物能特异性地捕获人血清白蛋白,磁分离复合物后,通过将兔抗人血清白蛋白抗体作为捕获抗体,将酶联羊抗人血清白蛋白抗体作为检测抗体,建立起间接酶联免疫法,用于检测人血清中和磁性免疫微球上吸附人血清白蛋白的浓度,得到微球从人血清中提纯人血清白蛋白的回收率。结果第1次提纯的回收率为(86±4)%,重复利用微球2次,回收率分别为(69.0±0.6)%和(40.8±0.8)%,而提纯的人血清白蛋白的纯度为90%。结论以上结果表明,免疫磁性微球提纯人血清白蛋白的实验是有效的,为工业上大规模提纯人血清白蛋白提供了一条新的思路。

三种免疫血清制备方法的比较

目的 :比较评价三种兔抗人全血清制备的方法 ,分析各种方法的优缺点及其适用范围 ,找到一种操作简便效果理想同时又节省抗原的方法。方法 :12只成年雄性家兔随机分三组 ,分别制订不同的免疫方案进行免疫 ,获取兔抗人全血清。结果 :混合免疫法不仅适用于抗原较少的抗血清的制备 ,而且操作方法简便 ,效果理想。结论 :混合免疫法较稳定、免疫效果较好。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的融合表达及兔抗血清的制备

以鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)Gt株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP2基因,经EcoR I/SalI酶双酶切处理后与经相同酶切处理的pET30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及序列鉴定正确的阳性重组子转化E.coliDE3菌,经IPTG诱导,表达的VP2蛋白通过Ni-NTA树脂纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗血清,并对其进行间接ELISA、IFA和Western blot分析。SDS-PAGE分析表明,在IPTG诱导下成功表达了约为50kDa的His-VP2融合蛋白;间接ELISA检测制备的兔抗血清效价在1:25 600以上;IFA及Western-blot分析结果表明,其可特异性结合真核表达的VP2蛋白以及IBDV全病毒。研究结果提示,兔抗VP2血清可用于VP2蛋白及病毒的检测,为进一步研究IBDV分子生物学功能提供了物质基础。

鸽毛滴虫感染Dot-ELISA检测方法的建立

为了制备兔抗鸽IgG抗体-HRP,建立斑点酶联免疫吸附试验定性检测鸽毛滴虫抗原的检测方法,将纯化的鸽IgG加入佐剂免疫兔子,获取纯化的兔抗鸽IgG抗体;采用简易过碘酸钠法标记兔抗鸽IgG,获取兔抗鸽IgG抗体-HRP;同时将鸽毛滴虫用超声波粉碎加入佐剂后多次免疫健康鸽获取鸽抗鸽毛滴虫高免血清(一抗);然后在2×106个/mL的鸽毛滴虫抗原量下,用不同浓度的一抗抗体、兔抗鸽IgG抗体-HRP进行试验;并对70个临床样品进行检测。结果显示,在2×106个/mL的鸽毛滴虫抗原量下,一抗与兔抗鸽IgG-HRP最佳工作浓度分别为1∶100和1∶500;70个样品中,48个镜检为阳性的样品用Dot-ELISA检测有44个呈阳性,阳性符合率为91.7%;22个镜检为阴性的样品用Dot-ELISA检测有12个呈阴性,阴性符合率为54.5%;Dot-ELISA检测与镜检结果的总符合率为80%。结果表明,本试验成功地建立了鸽毛滴虫感染的Dot-ELISA检测方法。

程序性死亡分子1胞外区的表达及其抗血清对PCV2增殖的影响

为研究猪的程序性死亡分子1(PD-1)胞外区参与猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)感染的免疫调节功能,PCR扩增健康猪舌组织中PD-1胞外区,构建重组表达质粒p ET-28a-PD-1,转化至Rosetta(DE3)。经IPTG诱导表达后,采用SDS-PAGE和Western Blot检测重组PD-1胞外段蛋白ex PD-1表达情况。结果显示,重组菌p ET-28a-PD1/DE3,在37℃、0.5 mmol·L-1 IPTG诱导8 h时,ex PD-1蛋白的表达量最高,大小约为20 kDa,且以包涵体形式表达。然后将经纯化和复性获得的ex PD-1辅以佐剂免疫新西兰兔,制备兔抗ex PD-1血清,经Western Blot检测结果显示该抗血清具有较好的反应原性。用PCV2感染猪肾(Porcinekidney-15,PK-15)细胞,采用荧光定量PCR检测PD-1转录水平,结果显示PCV2感染PK-15细胞1~48 h时PD-1的m RNA转录水平均下调;用兔抗ex PD-1血清处理PK-15细胞后感染PCV2,PD-1的转录水平显著上调(P<0.01),且明显地抑制了PCV2的复制(P<0.01)。上述结果表明,在体外PCV2感染可引起PD-1转录水平下调,兔抗ex PD-1血清可通过封闭PD-1/PD-L1通路,抑制PCV2增殖。

人初乳分泌片的纯化和兔抗人分泌片免疫血清的制备及应用

目的 获得足够量的分泌片 (SC)及其相应的抗血清 ,用于研究SC的功能与SC在人和某些物种黏膜组织内的分布。方法 在已有的凝胶过滤和离子交换层析的基础上 ,进一步通过亲和层析和凝胶过滤分离纯化人的SC并进行相应的鉴定。用免疫组织化学技术检测了SC在部分小鼠组织中的表达。结果 获得了免疫纯的SC ,并制备了相应的兔抗人SC的免疫血清 ;免疫组化显示 ,SC在小鼠小肠和子宫内膜处有表达。结论 利用改进的方法可以获得免疫纯的SC 。

水貂生长激素的原核表达及特异性抗血清制备

本研究旨在建立水貂生长激素(mink growth hormone,mGH)的原核高效表达体系,探索mGH蛋白规模化生产方法,利用获得的目的蛋白制备特异抗血清。将已构建的原核表达载体pET28b-mGH转化大肠杆菌Rosetta(DE3)TMpLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,超声破碎菌体后离心获得包涵体蛋白,利用8mol/L尿素对其进行溶解和复性,经Ni-NTA树脂亲和层析纯化获得重组蛋白。通过Western blotting检测及MALDI-TOFMS质谱分析对获得的蛋白进行鉴定。用SDS-PAGE电泳法检测蛋白纯度,用BCA法测定其浓度。复性mGH蛋白与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂乳化制备免疫抗原,采用皮下多点注射法免疫3只新西兰大白兔,首次免疫剂量为600μg/只,二免剂量为600μg/只,三免剂量为400μg/只。三免10d后分离制备血清,Western blotting法检测其特异性,间接ELISA法检测其效价。结果表明,原核表达的包涵体经Ni-NTA柱纯化后所得蛋白鉴定为mGH融合蛋白;SDS-PAGE电泳鉴定复性mGH蛋白条带单一,纯度达90%以上,BCA法计算蛋白浓度为669μg/mL,均达到了免疫动物的要求;制备的抗血清经Western blotting检测具有良好的结合特异性,间接ELISA法测定其抗体效价达1∶256 000以上。上述结果表明,原核表达载体pET28b-mGH可在大肠杆菌Rosetta(DE3)TMpLysS细胞中高效表达mGH融合蛋白,表达蛋白经变性、复性和纯化后免疫新西兰大白兔,可制备高效价特异性抗血清。

造血干细胞抗原的研究

兔抗鼠脑血清(RAMBS)系多价免疫血清.经同种红细胞、骨髓细胞和脚细胞吸收的RAMBS,在体外和体内,分别使83%和55%的骨髓造血干细胞丧失增殖分化和生成脾结书的活力.抗CFU-S的细胞毒作用能用成年鼠脑组织吸收而清除.实验结果表明,造血干细胞和成年鼠脑带有一种相同的抗原.本文对RAMBS的性质和少量存在的抗RAMBS的细胞亚群作了分析讨论.

利用SPA提取鼠IgG制备兔抗鼠IgG血清的尝试

本文首次用 SPA 提取鼠 IgG,制备兔抗鼠 IgG 血清,效价高,纯度好,方法简便,可靠。

抗肾小球基底膜抗体肾炎动物模型的建立及应用研究

目的:建立稳定的抗小鼠肾小球基底膜(GBM)抗体诱导的小鼠肾炎模型,用于相关药物药效学及机制的研究。方法:1制备含抗小鼠GBM抗体的兔血清。分离获得小鼠GBM组分,制备成冻干粉免疫家兔,得到含抗小鼠GBM抗体的兔血清。2建立抗小鼠GBM抗体诱导的小鼠肾炎模型。将兔Ig G与弗氏完全佐剂(CFA)充分乳化,于C57BL/6小鼠右脚脚掌注射进行致敏,3 d后尾静脉注射兔血清进行再次免疫。3肾炎小鼠口服肾上腺皮质激素类药物醋酸泼尼松龙(PNS)进行干预治疗,口服给药14 d,2 mg·kg-1·d-1,观察小鼠蛋白尿、蛋白肌酐比、血生化的变化。结果:注射含抗小鼠GBM抗体的兔血清(200μl,300μl,500μl),成功建立小鼠肾炎模型,模型小鼠蛋白尿及血清尿素氮(BUN)水平显著升高,血清白蛋白(ALB)水平明显降低,具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);PNS治疗后,能明显降低肾炎小鼠蛋白尿水平、蛋白肌酐比及BUN水平(P<0.05,P<0.01),缓解小鼠肾炎症状。结论:含抗小鼠GBM抗体的兔血清能够成功诱导小鼠肾炎模型,醋酸泼尼松龙能够有效发挥治疗作用,证实该模型可用于相关药物药效学及机制的研究。