肺炎衣原体感染通过PI3K激活Rac1而诱导血管平滑肌细胞迁移

目的:研究Rac1活化在肺炎衣原体(C.pn)感染诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)对其活化的影响。方法:谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-p21活化激酶1 p21结合结构域(PBD)即GST-PBD重组质粒转化感受态细菌,诱导融合蛋白表达并纯化;GST-pull down实验检测C.pn感染VSMCs后Rac1活性的变化;PI3K特异性抑制剂LY294002(25μmol/L)预处理VSMCs,GST-pull down实验检测Rac1活性的变化;Rac1特异性抑制剂NSC23766(50μmol/L)预处理VSMCs,wound-healing实验和Transwell实验观察VSMCs迁移能力的变化。结果:重组质粒转化感受态细菌后,经诱导表达和纯化,得到足量有效的GST-PBD融合蛋白;GST-pull down实验结果显示,C.pn感染VSMCs后Rac1活性增强且显著高于正常对照组(P<0.05);LY294002预处理VSMC后,C.pn感染诱导的Rac1活性明显下降(P<0.05);细胞迁移实验结果显示,NSC23766预处理的C.pn感染组细胞迁移能力明显低于单纯感染组(P<0.05)。结论:C.pn感染可能通过PI3K激活Rac1,从而诱导VSMCs迁移。

Rac1抑制剂联合替莫唑胺协同抑制胶质瘤细胞增殖活性和侵袭能力的体外研究

目的探讨Rac1抑制剂联合替莫唑胺对胶质瘤细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力的协同抑制作用。方法分别以Rac1抑制剂、替莫唑胺、Rac1抑制剂联合替莫唑胺于体外培养人胶质瘤细胞系U87和U251,噻唑蓝法、细胞迁移实验和细胞侵袭实验检测胶质瘤细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力。结果经Rac1抑制剂、替莫唑胺、Rac1抑制剂联合替莫唑胺培养后,U87和U251细胞增殖活性均降低(均P<0.05),且替莫唑胺的抑制作用强于Rac1抑制剂(均P<0.05),Rac1抑制剂联合替莫唑胺的抑制作用更强(均P<0.05);U87和U251细胞迁移能力[U87:空白对照(78.00±11.53)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(39.00±9.53)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(42.00±8.54)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(18.67±10.54)细胞数/低倍视野,P=0.001,0.001,0.000;U251:空白对照(75.00±4.00)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(37.00±5.56)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(36.00±9.00)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(14.33±5.50)细胞数/低倍视野,均P=0.000]和侵袭能力[U87:空白对照(64.33±4.04)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(30.33±3.51)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(24.00±2.64)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(11.00±2.00)细胞数/低倍视野,均P=0.000;U251:空白对照(77.33±3.06)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(40.67±4.04)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(37.33±4.51)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(15.33±2.52)细胞数/低倍视野,均P=0.000]均降低,尤以二者联合应用降低更明显(迁移能力U87:P=0.021,0.011;迁移能力U251:P=0.002,0.003;侵袭能力U87:P=0.000,0.001;侵袭能力U251:均P=0.000)。结论 Rac1抑制剂和替莫唑胺均可抑制胶质瘤细胞的增殖活性、迁移能力和侵袭能力,二者联合应用更具协同抑制作用。

Racl在正常及庆大霉素耳毒性损伤豚鼠耳蜗中的表达

目的研究庆大霉素所致耳毒性损伤及应用抗氧化剂水杨酸钠保护时Racl在豚鼠耳蜗中的表达，探讨RacI在庆大霉素耳毒性机制中的作用。方法健康雄性白色红目豚鼠30只，按随机数字表法分成3组。对照组：腹腔内注射生理盐水，连续7d；庆大霉素组：腹腔内注射硫酸庆大霉素，连续7d；庆大霉素＋水杨酸钠组：腹腔内注射硫酸庆大霉素和水杨酸钠，连续7d。7d后处死大鼠，采用石蜡切片免疫组织化学染色技术检测各组豚鼠耳蜗Racl蛋白的表达与分布情况；提取耳蜗蛋白，采用Westernblot检测各组Racl蛋白表达水平。结果对照组耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞Racl呈弱阳性表达，主要表达于细胞浆和细胞膜；庆大霉素组耳蜗Racl表达增强；庆大霉素＋水杨酸钠组呈阳性表达，其表达程度介于对照组和庆大霉素组之间；各组灰度值比较差异有统计学意义（P〈0．05）。对照组耳蜗Racl蛋白有低强度表达；庆大霉素组耳蜗Racl蛋白表达最强；庆大霉素＋水杨酸钠组耳蜗Racl蛋白表达程度介于对照组和庆大霉素组之间；各组间蛋白电泳积分光密度值比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Racl在正常豚鼠耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞的胞浆及胞膜弱表达，庆大霉素给药后耳蜗中Racl表达增强，同时给予抗氧化剂水杨酸钠后可使RacI表达较庆大霉素组减弱。提示Racl可能在庆大霉素导致耳蜗损伤过程中起作用。

微小RNA-182通过靶基因Rac1调控高糖诱导的心肌细胞肥大

目的探讨微小RNA（miR）-182调控高糖诱导的心肌细胞肥大的机制。方法利用生物信息学方法预测调控Ras相关的c3肉毒素底物1（Racl）的候选miR。在糖尿病组小鼠（db／db小鼠）和对照组小鼠（db／m小鼠）心肌组织中验证所有候选miR的表达，并分别与RaclmRNA做Pearson相关性分析。体外实验，将原代培养的乳鼠心肌细胞分为对照组（葡萄糖浓5mmol／L）和高糖组（葡萄糖浓度33mmol／L，HG组）。光镜下观察各组乳鼠心肌细胞的形态学变化。采用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组乳鼠心肌细胞中miR-182和RaclmRNA表达水平。再将原代乳鼠心肌细胞分为4组，分别为正常糖组（葡萄糖浓度5mmol／L，对照组）、高糖组（葡萄糖浓度33mmol／L，HG组）、正常糖＋miR-182模拟物组（miR-182组）和高糖＋miR-182模拟物组（HG＋miR-182组）。采用Lipofectamine2000转染miR-182模拟物（终浓度为100nmol/L）。分别采用RT．PCR和蛋白免疫印迹法检测乳鼠心肌细胞中Racl、3-肌球蛋白重链（B—MHC）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的mRNA和蛋白表达水平。结果生物信息学方法预测到参与调控Racl的候选miR共6个，分别为miR-182、miR-142—3p、miR-140、miR-101a、miR-429和miR-200b。糖尿病组小鼠心肌组织中miR-182和miR-142—3pmRNA表达水平均明显低于对照组（P均〈0．05），且miR-182、miR-142—3pmRNA均与RaclmRNA表达水平呈负相关（相关系数分别为r=-0．89102，r=-0．83719），miR．182与Racl负相关性最为显著。体外实验结果显示HG组乳鼠心肌细胞中miR-182mRNA表达水平明显低于对照组（P〈0．05），RaclmRNA表达水平则明显高于对照组（P〈0．05）；光镜下观察HG＋miR．182组乳鼠心肌细胞肥大程度轻于HG组；HG＋miR-182组乳鼠心肌细胞Racl和B—MHCmRNA及蛋白表达水平均明显高于HG组（P均〈0．05）。结论miR-182可能通过其靶基因Racl对高糖诱导的心肌细胞肥大进行调控。

血管内皮细胞生长因子激活Rac1引起肾小球内皮细胞通透性增高的机制

目的探讨细胞内Racl信号激活是否在血管内皮细胞生长因子（VEGF）增加肾小球内皮细胞的通透性和导致紧密连接酪氨酸磷酸化中起作用。方法采用原代培养的大鼠肾小球内皮细胞作为实验对象。通过体外研究，检测跨内皮细胞电阻抗观察不同浓度VEGF（5和50μg／L）对内皮细胞通透性的影响。内皮细胞转染野生型Racl和显性负性Racl质粒后，采用免疫沉淀和免疫印迹等方法观察上述效应是否源自Racl信号的激活，并观察紧密连接occludin蛋白酪氨酸磷酸化状态的改变。结果高浓度的VEGF（50μg／L）刺激可引起大鼠肾小球内皮细胞单层通透性显著增高（P〈0．05），并引起肾小球内皮细胞中GTP结合的Racl和膜结合的Hacl显著增加（P〈0．01），同时紧密连接蛋白occludin的酪氨酸磷酸化也增加（P〈0．05）。用Racl显性负性突变体转染肾小球内皮细胞能显著减弱VEGF对occludin蛋白酪氨酸磷酸化和内皮细胞通透性的影响（P〈0．05）。结论高浓度的VEGF可导致肾小球内皮细胞通透性增高，其与紧密连接蛋白occludin的酪氨酸磷酸化相关，这一作用需要Racl信号途径的激活。糖尿病中增高的VEGF可能通过Racl激活-occludin磷酸化导致肾小球内皮通透性增高，这可能是糖尿病肾病的发病机制之一。

NSC23766对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响

目的评价NSC23766对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。方法健康成年雄性SD大鼠，2～3月龄，体重250—300g，采用腹腔注射链脲佐菌素60mg／kg的方法制备糖尿病模型。取糖尿病模型制备成功的大鼠51只，采用随机数字表法，将其随机分为3组（n=17）：假手术组（S组）、缺血再灌注组（I／R组）和Racl特异性抑制剂NSC23766组（N组）。I／R组和N组采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，N组于缺血前15min经侧脑室注射NSC2376650μg，S组与I／R组给予等容量生理盐水。于再灌注24h时进行神经功能缺陷评分，然后处死大鼠，取脑组织，测定脑梗死体积，HE及Nissl染色，光镜下观察病理学结果，并测定细胞凋亡指数和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）磷酸化水平。结果与S组比较，I／R组和N组神经功能缺陷评分和细胞凋亡指数升高，脑梗死体积增大，p38MAPK磷酸化水平上调（P〈0．05）；与I／R组比较，N组神经功能缺陷评分和细胞凋亡指数降低，脑梗死体积缩小，p38MAPK磷酸化水平下调（P〈0．05）。结论NSC23766可减轻糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。

LMP1瞬时过表达对鼻咽癌CNE2细胞迁移的影响

目的 :探讨潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)瞬时过表达对鼻咽癌CNE2细胞迁移的影响及其可能的作用机制。方法 :成功构建重组真核表达载体pEGFP-C1-LMP1,并将其瞬时转染至CNE2细胞,激光共聚焦显微镜下观察LMP1在CNE2细胞中的定位,Transwell法检测LMP1对CNE2细胞迁移和侵袭能力的影响,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测LMP1和Ras相关C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)mRNA及蛋白的表达。结果 :pEGFP-C1-LMP1成功转染至CNE2细胞后,可见LMP1主要表达于细胞膜和部分细胞质中,CNE2细胞的侵袭和迁移能力明显低于转染空载体的对照组(P<0.05),CNE2细胞中LMP1 mRNA及蛋白的表达水平明显高于转染空载体的对照组(P<0.01),而Rac1 mRNA及蛋白的表达水平明显低于转染空载体的对照组(P<0.05)。结论 :LMP1瞬时过表达可抑制鼻咽癌CNE2细胞的迁移,这一作用可能与Rac1表达下调有关。

RhoA、Rac1及Cdc42在胆道闭锁肝纤维化中的作用

目的研究胆道闭锁（biliary atresia，BA）患儿肝组织中RhoA、Rac1及Cdc42表达情况与肝纤维化的关系，探讨其在BA发病中可能的作用机制。 方法选取胆管扩张症患儿肝组织（胆扩组）15例，BA患儿肝组织（BA组）15例，BA发展至肝硬化接受肝移植患儿自体肝活检组织（移植组）10例，采用HE观察肝组织标本纤维化程度；免疫组化染色检测RhoA、Rac1及Cdc42在肝组织中的蛋白表达情况；实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法检测肝组织中RhoA、Rac1及Cdc42基因表达情况。结果①HE染色：胆扩组偶见少许纤维组织增生；BA组汇管区增宽，纤维组织增生、桥接纤维化现象普遍，可见假小叶形成；移植组假小叶显著；②免疫组化：胆扩组RhoA、Rac1及Cdc42均表达为弱阳性，BA组及肝移植组患儿RhoA、Rac1及Cdc42蛋白在肝细胞、汇管区胆管上皮细胞中均为阳性表达；③半定量分析：RhoA（0.1419±0.0683、0.2203±0.0476和0.2295±0.0623），Rac1（0.1587±0.0072、0.1970±0.0242和0.1993±0.0270）和Cdc42（0.887±0.0270、0.1397±0.0360和0.1519±0.0168）在三组蛋白表达水平之间比较差异有统计学意义（P〈0.05），且三组中BA组及肝移植组RhoA、Rac1及Cdc42蛋白表达水平明显高于胆扩组（P〈0.05）；移植组RhoA、Rac1及Cdc42蛋白含量与BA组，表达差异无统计学意义（P〉0.05）；④qRT-PCR：RhoA[0.3350（0.2525～0.6350）、1.5200（1.4375～2.1700）和1.9350（1.7950～2.3925）]，Rac1[0.2800（0.1450～0.3025）、0.8200（0.7275～0.9300）和0.8000（0.7725～0.9825）]，Cdc42[0.5950（0.4375～0.7125）、1.8950（1.8675～2.1925）和1.9900（1.8675～2.2050）]，三组中mRNA表达水平比较差异有统计学意义（P〈0.017），同时在这三组中，BA组及肝移植组RhoA、Rac1及Cdc42含量表达明显高于胆扩组（P〈0.017）。结论RhoA、Rac1及Cdc42在BA患儿肝组织呈高水平表达，表明其可能参与并促进BA肝纤维进程。

RNA干扰Ras相关C3肉毒素底物1抑制大鼠视网膜新生血管生成

目的观察RNA干扰Ras相关C3肉毒素底物1（Racl—siRNA）重组载体对视网膜新生血管生成的抑制作用。方法25只成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，采用光动力疗法诱导双眼视网膜静脉阻塞后，1只眼玻璃体腔转染Racl-siRNA重组载体作为基因干预组，另1只眼注射空白载体作为空白对照组。25只SD大鼠单眼玻璃体腔内转染Racl—siRNA重组载体作为空白干预组。2周后对3组大鼠进行心内灌注右旋异硫氰酸荧光素，视网膜铺片，检测视网膜新生血管生成情况。摘除3组大鼠眼球，苏木素-伊红染色后计数突破内界膜的内皮细胞数。结果视网膜铺片发现，空白对照组视网膜产生大片新生血管，大量荧光素渗漏；基因干预组仅见小片状新生血管网，少量荧光素渗漏；空白干预组呈正常血管形态。基因干预组大鼠视网膜切片中，突破内界膜的血管内皮细胞平均数与空白对照组和空白干预组比较，两两间差异具有统计学意义（F=47．168，P=0．000）。结论Racl-siRNA重组载体能有效抑制体内视网膜新生血管的生成。

Wnt5A基因过表达对黑素细胞骨架蛋白的影响

目的 探讨携带Wnt5A全基因序列的质粒转染原代黑素细胞后，Wnt5A表达升高对黑素细胞骨架蛋白的影响。方法 培养原代人表皮黑素细胞，并分为3组：①空白对照组：除细胞外不加任何试剂；②阴性对照组：加入空白的去内毒素pcDNA3.1（＋）质粒、Opti-MEM培养基及Lipo3000；③Wnt5A质粒组：加入Wnt5A去内毒素pcDNA3.1（＋）质粒、Opti-MEM培养基及Lipo3000。Wnt5A质粒转染黑素细胞，采用qPCR法检测各组Wnt5A、Ras相关C3肉毒素底物1（Rac1）、丝状肌动蛋白（F肌动蛋白）和β微管蛋白基因表达，Western印迹法测定Wnt5A、酪氨酸激酶受体2（ROR2）、Rac1、F肌动蛋白和β微管蛋白表达，并通过细胞免疫荧光试验观察细胞骨架蛋白表达情况。结果 qPCR法显示，Wnt5A质粒组、阴性对照组和空白对照组Wnt5A mRNA及其下游基因Rac1和F肌动蛋白mRNA表达量3组间差异均有统计学意义（F = 1 374.179、112.576、66.458，均P 〈 0.01），但β微管蛋白mRNA表达差异无统计学意义（P 〉 0.05）。Wnt5A质粒组Wnt5A、Rac1和F肌动蛋白mRNA表达量均显著高于空白对照组及阴性对照组（P 〈 0.05）。Western印迹法显示，Wnt5A质粒组Wnt5A蛋白表达较空白对照及阴性对照明显升高，差异均有统计学意义（P 〈 0.05）。Wnt5A质粒组Rac1、ROR2、F肌动蛋白表达均明显低于空白对照组和阴性对照组（P 〈 0.05），但β微管蛋白表达在3组间差异无统计学意义（P 〉 0.05）。细胞免疫荧光实验显示，Wnt5A质粒组绿色（β微管蛋白）、红色（F肌动蛋白）荧光强度与两个对照组相比均无明显差别，但黑素细胞体积明显增大，树突数目明显增多，细胞骨架显著改变，表现为F肌动蛋白强弱不一，纹理模糊，张力丝断裂，局部呈团块状。结论 黑素细胞Wnt5A基因表达升高可调控细胞骨架相关基因及蛋白表达，使黑素细胞体积增大、树突增多、骨架改变，可能有利于黑素小体的输送传递，参与色素沉着性疾病的发病。

Ras1、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异

目的 研究Ras1、Rac1和Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异，探讨其在菌丝生长过程中的作用。方法 分别培养阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相，提取两组的总RNA，采用荧光定量PCR方法测定两组中Ras1、Rac1和Rho1 mRNA的相对表达量。结果 酵母相菌丝生成率（0.40% ± 0.53%）显著低于菌丝相（99.33% ± 0.57%，t = 13.93，P 〈 0.05）。实时荧光定量PCR显示，以酵母相为对照组，将其Ras1、Rac1、Rho1基因表达量均设为1，则菌丝相的Ras1、Rac1、Rho1基因mRNA相对表达量分别为25.17 ± 10.99、16.81 ± 7.80、42.61 ± 18.50，与酵母相比较，差异有统计学意义（t值分别为3.81、3.51、3.90，均P 〈 0.05）。结论 Ras1、Rac1、Rho1基因可能参与了阿萨希毛孢子菌菌丝的生长过程。