鸡小黄卵泡颗粒细胞的培养条件优化

为了研究禽类颗粒细胞的功能,建立一套良好的颗粒细胞培养体系至关重要。该研究分离培养了产蛋高峰期母鸡的6~8 mm小黄卵泡颗粒细胞,在细胞基质、不同物种血清、血清浓度上进行优化。结果表明,鼠尾胶原比明胶预铺更能促进颗粒细胞生长,细胞传代至4代才发生死亡。2.5%鸡血清与2.5%FBS(fetal calf serum)、2.5%鸡血清+2.5%FBS相比,2.5%鸡血清传代后细胞形态优于其他组。显微镜观察和EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)检测表明,随着鸡血清浓度的增加,颗粒细胞增殖增加。该研究建立了在预铺鼠尾胶原作为胞外基质,采用含5%鸡血清的培养体系,使得鸡小黄卵泡颗粒细胞传代后仍能保证其增殖特性。

以鼠尾胶为贴黏剂的小鼠淋巴管内皮细胞培养体系的建立

目的:建立一个简便、廉价和稳定的小鼠淋巴管内皮细胞(LEC)培养体系.方法:应用不完全弗氏佐剂诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,消化法分离获得LEC,置于自制的鼠尾胶包被的培养瓶(板)中培养.以免疫荧光化学法检测LEC特异性标记物VEGFR-3和LYVE-1的表达,以3H-TdR掺入率测定和细胞倍增时间检测LEC的增殖活力,以淋巴管形成试验判定LEC能否形成淋巴管样结构.结果:不完全弗氏佐剂能诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,所获LEC活细胞数大于98%.免疫荧光化学检测表明,LEC表达VEGFR-3和LYVE-1.在鼠尾胶包被的培养瓶(板)中,LEC生长状况良好,3H-TdR掺入率明显增加,倍增时间为(42.7±3.2)h;在鼠尾胶凝胶中,LEC能形成淋巴管样结构.结论:鼠尾胶为贴黏剂的体系是一种简便、廉价和稳定的小鼠LEC培养体系.

以鼠尾胶原为支架的真皮类似物的建立

目的:探寻建立真皮类似物的培养方法。方法:原代培养人皮肤成纤维细胞,制备鼠尾胶原,将鼠尾胶原溶液、浓缩培养基、NaOH溶液和以血清重悬的成纤维细胞溶液在适当的比例下混合后形成凝胶构建真皮类似物。结果:形成的真皮类似物中成纤维细胞生长状态良好,并且组织块具有一定弹性和抗拉伸能力。结论:①利用鼠尾胶原可以构建真皮类似物,该模型是进行皮肤器官型培养和制作复合皮的关键与基础;②成纤维细胞胶原凝胶复合物有着良好的生物学特性,它是研究成纤维细胞与细胞外基质之间以及细胞之间相互作用的良好模型。

鼠尾胶原为底物的人鼻腔纤毛上皮细胞培养模式的建立

目的建立以鼠尾胶原为贴附底物的人鼻腔纤毛上皮细胞的体外培养模式,为人鼻腔黏液纤毛运输系统的研究提供科学有效的方法。方法制备鼠尾胶原并铺片,以鼠尾胶原为贴附底物组织块培养法培养人鼻腔纤毛上皮细胞,培养7天时进行HE染色及扫描电镜和透射电镜观察细胞形态和结构,应用高速摄像技术测量纤毛摆动频率。结果鼠尾胶原要平坦均匀,平均厚度约为1mm;HE染色可见上皮细胞呈单层向周围爬开;扫描电镜下见纤毛上皮细胞呈不规则多角形,纤毛周围可见微绒毛;透射电镜下可见纤毛上皮细胞间为紧密连接;同一细胞任意两点纤毛摆动频率是相同的;同一来源体外培养的钩突和下鼻甲的纤毛摆动频率是相同的。结论以鼠尾胶原为贴附底物人鼻腔纤毛上皮细胞的体外培养模式的成功建立,为今后研究鼻内用药对纤毛清除功能的影响提供了良好的方法和途径。

外周血来源内皮祖细胞三维血管新生模型的建立及其特性分析

目的观察内皮祖细胞(EPC)在血管新生中的作用及其生物学特性。方法取大鼠外周血分离出EPC,观察其在体外的培养和扩增情况,对培养的EPC进行检测,同时建立三维立体模型并分析。结果成功分离出外周血中的EPC,在平面培养时,各时间点经VEGF诱导的EPC(实验组)其增殖情况均优于无VEGF诱导的EPC(对照组),P<0.01。在由鼠尾胶原凝胶制成的三维基质中EPC向胶原基质内生长,1d内即可出现向胶原内的出芽及浸润,并逐渐形成分支样结构;实验组生长快,向胶原基质内浸润速度快、出芽快,管状结构粗大;而对照组生长慢、出芽慢,管状结构细小,向胶原内浸润的深度浅,网状结构稀疏,不完整;实验组各时相三维基质中新生血管数目均多于对照组(P<0.01)。结论鼠尾胶原凝液可以诱导EPC参与血管新生的迁移、增殖、发芽等步骤;EPC三维基质模型可用于新生血管的研究。VEGF能动员和诱导EPC促进血管新生。

鼠尾胶原在培养鼠下切牙颈环上皮细胞中的应用

目的:建立用自制鼠尾胶原为贴附底物的大鼠颈环上皮细胞的体外培养模式。方法:制作鼠尾胶原,观察用自制的鼠尾胶原培养出大鼠颈环上皮细胞的效果,并对纯化的上皮细胞进行免疫组织化学染色鉴定。结果:自制的鼠尾胶原能正常地培养出大鼠颈环上皮细胞,呈多角形,克隆状生长,β1整合素和角蛋白免疫组织化学染色阳性。结论:鼠尾胶原可作大鼠颈环上皮细胞的体外培养贴附底物,为今后研究牙齿发育机制提供简便的方法和途径。

鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定

目的建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法。方法通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化。超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白。通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定。结果本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯。与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异。研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了最优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量:1∶500,酶解时间:72 h,盐析浓度:2 mol/L,提取所用酸溶液:0.05mol/L醋酸溶液。结论为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础。

鼠尾胶为贴黏剂的微血管内皮细胞培养

目的:以鼠尾胶为贴黏剂,建立一种成本低且生长状态良好的微血管内皮细胞体外培养体系。方法:无菌条件下制作鼠尾胶,并均匀铺在培养皿中。分离收集脑微血管段,接种于铺有鼠尾胶的培养皿中进行培养。用内皮细胞的两种重要标记物VIII因子相关抗原和γ-谷氨酰转酞酶(-γglutamyl-transpeptidase,γ-GT)鉴定细胞,并以3H-TdR掺入法观察培养细胞对血清刺激的增殖反应性。结果:显微镜观察从脑微血管段生长出的细胞具有内皮细胞生长特性:单层“卵石样”排列特征和接触生长抑制;VIII因子免疫组织化学染色呈阳性;培养上清含有大量的γ-谷氨酰转酞酶[(5.01±0.07)IU/L];证实鼠尾胶做为贴黏剂获得的是内皮细胞。10%胎牛血清刺激后3H-TdR掺入率较对照组增加87.5%(P<0.05)。结论:本研究用鼠尾胶做为贴黏剂,降低微血管内皮细胞培养成本,且细胞生长状态良好,表明该方法是一种比较经济可靠的微血管内皮细胞培养体系。

两种不同基质对体外培养成骨细胞促贴壁生长的影响

目的比较多聚赖氨酸(PoLy lysine PLL)与鼠尾胶原对成骨细胞体外培养生长的影响。方法分别采用PLL和鼠尾胶原铺制培养皿,然后接种成骨细胞。于24 h、48 h、72 h镜下观察细胞形态及占培养皿面积的百分比。结果 24 h PLL组,细胞贴壁呈均匀分布状,贴壁面积比为(30.6±12.9)%;鼠尾胶原组细胞贴壁呈团状,贴壁面积比为(42.5±15.7)%,两者比较差异显著(P<0.05);48 h PLL组,细胞呈均匀分布生长,贴壁面积比为(43.8±14.5)%;鼠尾胶原组,细胞团相互连接,生长面积比为(61.3±17.1)%,差异极显著(P<0.01);72 h PLL组细胞相互连接生长面积比为(56.3±15.4)%;鼠尾胶原组,细胞连成片,生长面积比为(94.4±14.1)%,两者比较差异极显著(P<0.01)。结论对体外培养成骨细胞鼠尾胶原促贴壁生长比PLL更为适宜。

正交试验法提取鼠尾腱胶原工艺的优化

目的:探讨浸提时间、乙酸浓度及料液比对鼠尾腱胶原提取的影响,建立并优化鼠尾腱胶原的提取工艺,提高胶原提取效率。方法:选取健康SD大鼠鼠尾,采取酸溶法提取鼠尾腱胶原,观察不同浸提时间(12、24、48、72和96h)、乙酸浓度(0.10、0.25、0.50、0.75和1.00mol·L-1)及料液比(g∶mL)(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40和1∶80)对胶原提取率的影响,利用正交试验判断浸提时间、乙酸浓度及料液比等影响因素的最佳工艺参数。通过SDS-PAGE电泳实验、单宁酸沉淀实验和傅里叶红外光谱实验等对提取的胶原进行鉴定。结果:单因素分析,胶原提取率在一定参数范围内随浸提时间、乙酸浓度及料液比的增加而增加。正交试验,鼠尾腱胶原提取的最佳工艺参数为浸提时间72h、乙酸浓度0.5mol·L-1、料液比为1∶40。SDS-PAGE电泳显示,样品为Ⅰ型胶原,单宁酸沉淀实验显示胶原降解程度低,傅里叶红外光谱显示胶原结构完整。样品氨基酸含量测定符合胶原蛋白的成分特征。中性胶原溶液在37℃时能够形成固态胶原凝胶,胶原凝胶经过碳化二亚胺(EDC)交联后,扫描电镜下显示内部相互连接,构成孔径适中的蜂窝状多孔结构。结论:成功建立并优化鼠尾腱胶原蛋白的提取工艺,得出浸提时间、乙酸浓度及料液比等因素的最佳工艺参数,有效提高了鼠尾腱胶原的提取效率。

鼠尾胶原蛋白海绵止血作用研究

目的制备一种高纯度的鼠尾胶原蛋白海绵,研究鼠尾胶原海绵的止血作用。方法用制备的鼠尾胶原蛋白海绵对新西兰兔耳缘静脉、耳缘动脉、肝脏、股动脉创面止血,观察其止血时间、敷料与创面的黏合情况、再出血、渗血和吸收及伤口愈合情况。结果鼠尾胶原海绵组、胶原蛋白海绵组耳缘动脉、肝脏、股动脉创面止血时间与对照组比较明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05);同时,鼠尾胶原海绵组在肝脏、股动脉创面止血时间比胶原蛋白海绵组缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。鼠尾胶原蛋白海绵在对创面的修复性能上优于胶原蛋白。结论鼠尾胶原蛋白及其冻干海绵可以作为人工皮肤及创伤敷料研究的首选材料,同时也为鼠尾胶原蛋白海绵用于止血、创面修复及进一步研究其止血机制提供事实依据。

鼠尾肌腱胶原蛋白的提取及凝胶的制备

为了探索鼠尾肌腱胶原蛋白在实验医学中的应用，用简单的方法溶解新鲜大白鼠鼠尾肌腱，从中提取较纯的胶原蛋白，制成胶原凝胶。将提取的胶原蛋白液进行定性、定量鉴定。结果：提取液主要为Ⅰ型胶原蛋白；72小时37℃恒温培养箱内培养无细菌生长；紫外分光光度计测定，吸收高峰为230nm；氨基酸成分主要为甘氨酸：占40％．辅氨酸：14．3％。显微镜下见：相互交织的胶原原纤维结构组成的网状结构；纤维均匀．有规则横纹。胶原蛋白液在37℃恒温下，可制成凝胶，用于培养细胞；用磷酸液冲洗胶原蛋白凝胶可成固体片状，制成胶原膜，用作医用材料。

大鼠心肌微血管内皮细胞的分离培养和鉴定

目的建立心肌微血管内皮细胞培养模型。方法以1%～2%鼠尾胶原对培养皿作预处理,采用胶原酶和胰蛋白酶两次消化法从SD大鼠心肌分离培养微血管内皮细胞。结果通过形态学特征及微血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度大鼠心肌微血管内皮细胞。结论以鼠尾胶原对培养皿作预处理,采用蛋白酶消化及机械剪切、过滤的方法培养大鼠心肌微血管内皮细胞,纯度和获得率均较高。

肺生物基质及鼠尾胶对日本血吸虫培养细胞影响的研究

目的 研究细胞外基质 (ECM)对日本血吸虫培养细胞生存、生长的影响 ,佐证 ECM有利于培养细胞的生存、生长。方法 将虫龄 2 1d的日本血吸虫细胞接种于预先涂有肺生物基质、鼠尾胶的培养瓶和小盖玻片上常规培养 ,分别在光镜及扫描电镜下观察、拍照 ,并运用酶细胞化学方法进行培养细胞的乳酸脱氢酶 (L DH)染色。对照组未涂生物基质。结果 与对照组相比 ,实验组细胞饱满 ,弹性好 ,立体感强 ,存活时间长 ,L DH活性强 ,对高温具一定的耐受性 ;尤其是肺基质中培养的细胞 ,酶活性最强 ,培养 6 0 d的细胞仍观察到具有分裂能力。结论 ECM能改善日本血吸虫培养细胞生存、生长的微环境。实验组间比较 。

鼠尾Ⅰ型胶原的酸解、纤维重构和仿骨生物矿化研究

目的：利用鼠尾Ⅰ型胶原构建与人类自体骨组织化学成分和分子结构相近的仿生骨材料。方法：通过醋酸酸解提取鼠尾Ⅰ型胶原蛋白，并重构成胶原纤维。然后，将重构后的胶原纤维放置在矿化液中模仿骨生物矿化2—6d，通过透射电子显微镜和电子衍射观察骨生物矿化。结果：酸解提取的鼠尾Ⅰ型胶原蛋白能够重构成胶原纤维，并且具有特征性的D-Band结构。透射电子显微镜和电子衍射显示：矿化2d后，羟基磷灰石钙前体渗入胶原纤维，胶原纤维部分矿化；矿化6d后，胶原纤维内部完全矿化，形成Ⅰ型胶原蛋白／羟基磷灰石钙的仿生骨材料。结论：利用酸解法提取的鼠尾Ⅰ型胶原蛋白可以重构成胶原纤维，经矿化可形成与人类自体骨组织化学成分和分子结构一致的仿生骨材料。

不同基质对兔气管纤毛上皮细胞贴壁生长的影响

目的比较几种不同培养基质对兔气管纤毛上皮细胞贴壁生长的影响,探讨兔气管纤毛上皮细胞体外培养最佳生长基质。方法用组织块法比较兔气管纤毛上皮细胞分别在新鲜配制鼠尾胶原、市售鼠尾胶原、多聚赖氨酸和明胶4种基质上的贴壁和生长状况。结果兔气管黏膜上皮组织在4种基质上的贴壁率分别为:新鲜配制胶原89.1%,市售胶原43.5%,多聚赖氨酸36.9%,明胶21.7%;贴壁组织的单细胞层最大生长半径分别为:新鲜配制胶原(1 432.2±383.2)μm,市售胶原(928.9±390.3)μm,多聚赖氨酸(889±229.2)μm,明胶(651±221.2)μm;纤毛摆动最大频率及持续时间分别为:新鲜配制胶原(10.0±1.5)Hz 11 d,市售胶原(8.5±0.6)Hz 5 d,多聚赖氨酸(8.9±0.5)Hz 3 d,明胶(5.9±0.3)Hz 2 d。扫描电镜下新鲜配制鼠尾胶原纤维成条索状,相互交织成网,利于组织贴壁和细胞生长。结论在常用的4种培养基质中,新鲜配制的鼠尾胶原是兔气管纤毛上皮细胞体外培养的最佳生长基质,是纤毛功能研究的可靠保证。

药用载体胶原的提取与鉴别

目的对胶原蛋白这种新型药物载体的提取、纯化与鉴别作较为全面的研究。方法采用酸提法从鼠尾肌腱中提取I型胶原蛋白,并用紫外扫描法、SDS-PAGE和IEF进行分析和鉴别。结果实验证实从鼠尾肌腱中提取的胶原为I型胶原蛋白并得到其相应的分子量及等电点PI。结论本实验为药物载体胶原的提取与鉴别、提供了简便易行的方法。

涎腺腺样囊性癌细胞侵袭鼠尾胶原的实验观察

为了研究涎腺腺样囊性癌对Ｉ型胶原的侵袭能力，本实验利用鼠尾胶原作培养基，接种涎腺腺样囊性癌细胞系ＡＣＣ２和高转移细胞株ＡＣＣＭ，以研究其侵袭能力。结果发现，肿瘤细胞紧密粘附胶原上，部分形成单层或复层，高转移细胞（ＡＣＣＭ）形成侵袭灶，并形成类似腺管样结构，说明高转移细胞株对Ｉ型胶原具有更强的侵袭能力。

Ⅰ型鼠尾胶原三维培养模型对树突状细胞形态及分泌能力的影响

目的:通过构建Ⅰ型鼠尾胶原三维(3D)培养模型,探索细胞外力学微环境对DCs产生的影响。方法:取健康人外周血来源的CD14+单核细胞,利用重组人白介素-4(rh IL-4)和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)共同诱导5 d,获得未成熟DCs(im DCs),再利用重组人干扰素-γ(rh IFN-γ)和脂多糖(LPS)诱导im DCs为成熟DCs(mDCs);再利用鼠尾肌腱提取Ⅰ型鼠尾胶原体外培养DCs;FITC-Annexin-V和碘化丙啶(PI)标记细胞,检测DCs的凋亡率;酶联免疫吸附测定法检测DC的白细胞介素-12(IL-12)、IL-18和IL-1β的分泌水平。结果:与对照组相比,3D力学环境处理后细胞形态发生改变,细胞早期凋亡率降低,IL-18和IL-1β的分泌能力发生下调(P<0.05)。结论:细胞外3D力学微环境能够调控DCs的免疫功能。

小鼠皮肤组织原代黑色素细胞培养条件的优化

为了优化小鼠原代黑色素细胞培养条件,试验以出生1 d的小鼠背部皮肤组织为材料,在培养过程中分别比较不同消化时间、是否向培养基中添加鼠尾胶原蛋白、首次换液时间对原代黑色素细胞培养的影响,通过观察黑色素细胞形态和生长状态以及台盼蓝染色计数细胞研究小鼠黑色素细胞的原代培养条件。结果表明:小鼠原代黑色素细胞的培养条件为消化时间10 min、培养基使用含鼠尾胶原蛋白的培养基、首次换液时间24 h,可以获得大量处于良好生长状态的黑色素细胞。说明小鼠原代黑色素细胞培养条件优化成功。