FQ-PCR溶解曲线技术分析白血病患者PBMC中T细胞TCRα/βCDR3谱系特征

目的采用FQ-PCR溶解曲线技术分析临床白血病患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TRAV和TRBV基因各家族的CDR3谱系特征。方法提取4例健康志愿者和15例临床白血病患者PBMC中mRNA,逆转录成cDNA,FQ-PCR扩增32个TRAV基因和24个TRBV基因家族的CDR3区,FQ-PCR溶解曲线技术分析CDR3谱系特征,并测序分析单克隆家族CDR3区氨基酸序列的组成。结果 4例健康志愿者PBMC中α/βT细胞的CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,均表现为多峰图;而15例白血病患者PBMC中α/βT细胞CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,多数患者出现寡或偏峰型图、低或无峰型图、典型的单峰型图;不同白血病患者异常峰的频率不一致;单峰型图TRAV和TRBV PCR产物基因测序,未发现不同患者存在完全相同的CDR3区。结论FQ-PCR溶解曲线技术能很好的分析白血病患者PBMC中TCRα/βCDR3谱系的单、寡、多克隆性增殖;非T细胞白血病患者PBMC中TCRα/βCDR3的单峰(或寡峰)家族T细胞,可能来源于机体对肿瘤应答的T细胞,而在T细胞白血病患者,可能为肿瘤T细胞或机体抗肿瘤T细胞。本实验可为进一步研究白血病的免疫应答机制和个体化治疗提供基础。

扶正解毒颗粒对染镍大鼠肾组织及尿单核细胞趋化蛋白-1水平的影响

目的研究中药扶正解毒颗粒(FJG)对硫酸镍(NiSO4)暴露肾组织单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA表达的影响。方法 Wistar大鼠NiSO4(2.5 mg.kg-1.d-1)染毒造模,FJG灌胃处理,分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法和双缩脲比色法检测尿MCP-1和24 h尿蛋白含量;采用实时荧光定量RT-PCR检测肾组织MCP-1 mRNA表达的变化。结果 NiSO4组肾细胞MCP-1mRNA表达增强,尿MCP-1和24 h尿白蛋白含量增加;FJG组MCP-1 mRNA表达水平明显低于NiSO4组(RSD分别为4.3%,6.9%,7.4%),FJG组尿MCP-1和24 h尿白蛋白含量明显低于NiSO4组(P<0.05和P<0.01)。结论 MCP-1mRNA表达增强、尿MCP-1含量增加与镍性肾损伤存在一定关联,FJG干预镍肾毒性的作用可能与下调MCP-1mRNA表达及降低尿MCP-1水平有关。

采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨

目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

糖皮质激素受体在类风湿关节炎外周血单个核细胞中表达水平的研究

目的探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞中糖皮质激素受体(GR)α、βmRNA的表达水平及其与RA发病机制、活动性的关系。方法从44例RA患者(活动期24例、缓解期20例)、20例健康对照人群外周血单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)检测GRα和GRβmRNA的表达水平,并研究其与血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)的相关性。结果RA患者GRα和GRβmRNA的表达水平均明显高于健康对照人群(P﹤0.01);活动期RA患者GRβmRNA表达水平(-3.5442±0.8017)明显高于缓解期RA患者(1.2175±1.5969)(P﹤0.01);活动期RA患者GRαmRNA表达水平(4.2333±2.1775)与缓解期RA患者(4.2985±1.6109)比较无显著性差异(P﹥0.05);RA患者GRβ表达水平与CRP呈正相关(P=0.01),与ESR、RF均无关;RA患者GRα表达水平与CRP、ESR、RF均无关。结论GRα和GRβ的表达异常可能参与了RA的发病;GRβ表达水平与CRP呈明显正相关,提示其可能与RA疾病活动性相关。

“荧光定量PCR溶解曲线法”监测HIV感染者TCR α链CDR3谱系漂移的研究

目的利用"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测HIV感染者外周血T细胞TCRα链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取6例HIV感染者、4例健康者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,设计人32个TRAV基因家族上、下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果健康者外周血T细胞TCRα链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多克隆增生的高斯分布,呈现溶点不同的CDR3多态性,6例HIV感染者的外周血TCRα链CDR3谱系的32个家族CDR3表达频率不一致,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCRα链CDR3谱系漂移的方法稳定、简便,可以用来监测健康者和HIV感染者外周血T细胞TCRα链CDR3谱系漂移。