梅花鹿DLX5基因克隆及表达分析

为研究梅花鹿(Cervus nippon)DLX5基因的结构和功能,进一步探究其与梅花鹿茸角骨化机制间的关系,采用RT-PCR技术对梅花鹿DLX5基因进行克隆,获得包含全部编码区的c DNA序列,对该基因的氨基酸序列进行生物信息学分析并构建系统进化树,通过KEGG富集分析其信号通路,运用实时荧光定量RT-PCR检测该基因在鹿茸生长不同时期的表达情况。结果表明:梅花鹿DLX5基因编码区长为870 bp,共编码289个氨基酸。DLX5蛋白为可溶性的不稳定蛋白,有2个保守结构域,主要定位于细胞核。梅花鹿DLX5蛋白与许多不同物种来源的DLX5蛋白氨基酸序列有较高相似度,比较保守。DLX5蛋白二级结构中无规则卷曲占比最大(78.89%),其后依次是α-螺旋、延伸链,占比分别为16.96%和4.15%。DLX5基因主要的作用通路为TGFβ信号通路、MAPK信号通路和Wnt信号通路等。实时荧光定量RT-PCR结果表明,DLX5基因在鹿茸生长后期(三杈茸)表达量显著增高,这种上调表达暗示了其在鹿茸骨化过程中发挥重要作用,说明其可能是鹿茸骨化相关候选基因。

基于SMRT测序技术的塔里木马鹿冬季肠道菌群多样性分析

为探究塔里木河流域塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)冬季肠道菌群群落结构、多样性与功能,采用PacBio平台的单分子实时测序技术(single molecule realtime sequencing,SMRT)对塔里木河上游湿地自然保护区采集并筛选的25份塔里木马鹿粪便样本的16S rRNA基因全长进行测序,共获得298578个clean reads,clean reads聚类获得28026个OTU,包括25门684属。Alpha多样性分析结果显示,塔里木马鹿冬季肠道菌群Shannon指数为(7.764±0.044),Simpson指数为(0.015±0.001),Chao1指数为(12242.668±695.106),ACE指数为(9366.423±407.612)。塔里木马鹿优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes,60.51%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,26.02%)、变形菌门(Proteobacteria,3.61%)、疣微菌门(Verrucomicrobia,1.57%)和浮霉菌门(Planctomycetes,1.46%)。相对丰富度在前10的菌属为Papillibacter(5.48%)、拟杆菌属(Bacteroides,5.12%)、Muribaculum(4.69%)、Phocaeicola(4.49%)、Lawsonibacter(4.31%)、瘤胃球菌属(Ruminococcus,4.09%)、Intestinimonas(3.06%)、普氏菌属(Prevotella,2.87%)、克里斯滕森菌属(Christensenella,2.71%)和弯曲杆菌属(Campylobacter,2.54%)。PICRUSt 16S功能预测结果表明,塔里木马鹿肠道菌群基因功能主要富集于新陈代谢(48.58%)、遗传信息处理(19.04%)和环境信息处理(12.08%);其中新陈代谢主要以碳水化合物代谢(9.47%)、氨基酸代谢(9.93%)为主,并且环境信息处理的膜转运(9.96%)基因相对丰富度最高。研究揭示了野生塔里木马鹿冬季肠道菌群特征和功能,为塔里木马鹿野生种群的保护提供基础数据。

汉画中鹿图像文化阐释

汉画中有关鹿的画面,可分为猎鹿和神鹿。猎鹿是汉代人对原始社会狩猎活动的一种集体无意识反映;神鹿具有升仙工具、阴性象征及祥瑞象征的性质,与鹿的奔走、性情、生育特征、医药功能以及"物候历法"的作用密切相关。在鹿神话的基础上又形成了飞廉、麒麟、天禄等神话。

应用实时PCR检测红鹿感染牛型结核杆菌后IFN-γ和IL-4mRNA的表达

目的 揭示红鹿抗结核杆菌感染的免疫反应途径。方法 共采用 2 0只红鹿 ,其中一组 10只对牛型结核杆菌(Mycobacteriumbovis,M bovis)有自然抵抗力 ,另一组 10只对M bovis敏感。两组各取 5只接种活的卡介苗 (BCG) ,余下 5只不接种。接种卡介苗 8周后所有的红鹿都注射有毒力的M bovis,在注射M bovis4周前以及 6周后分别收集外周血单核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells ,PBMC) ,PBMC在与美洲商陆原 (PokeweedMitogen ,PWM)共育后测定细胞因子Inter feron -γ(IFN -γ)和Interleukin - 4 (IL - 4 )mRNA的表达水平。mRNA的定量测定是在ABIPRISM 770 0序列检测系统上应用TaqManReal-time11PCR技术进行的。结果 在红鹿接受M bovis刺激前后PBMC中IFN -γ和IL - 4mRNA的表达水平有显著性差异。结论 红鹿抵抗结核杆菌感染的免疫反应是复杂的混合细胞反应型 ,Th1,Th2细胞反应均加强。

林麝源化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌,分别根据化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌ICEMh1基因和肺炎链球菌pspC基因的特异性序列设计引物和探针,以重组质粒a.p-m.h1-s.p为标准品,通过优化反应条件,建立一种检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏度和可重复性进行测试。结果表明,建立的方法对标准品阳性质粒的最低检测量为20拷贝,标准曲线在1.25×10^6 copies/μL^1.0×101 copies/μL范围内具有良好的线性关系。对2016年-2018年在陕西省收集的病料中化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌检出率分别为66.67%、5.5%和44.44%。建立的三重实时荧光定量PCR方法能快速、准确和稳定地检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌。

实时荧光PCR法检测食品中梅花鹿成分

采用实时荧光聚合酶链式反应技术检测食品中梅花鹿成分。通过对梅花鹿基因序列对比分析,选取种间差异大、种内差异小的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因序列作为靶序列,利用Primer Express、Oligo和DNAMAN等软件设计了梅花鹿特异性的引物和Taq Man探针,并用已知样本对引物和Taq Man探针的物种特异性、检测灵敏度进行验证和检测。实验结果表明,引物和探针对梅花鹿成分检测的特异性良好,与其他物种DNA无非目标扩增,对梅花鹿DNA的扩增效率为91.68%,该方法的检测灵敏度达0.42 pg/反应。

鹿不同组织中H-FABP与E-FABP基因的表达

以雄、雌性梅花鹿和雌性马鹿为试验对象,以鹿的心(乳头肌)、肝(左叶)、肺(右肺上叶)、肌肉(背最长肌、肋间肌、臀大肌、股四头肌)和皮下脂肪8种组织样品为试验材料,采用实时荧光定量PCR技术检测H-FABP、E-FABP基因在各组织中的表达量及其差异。结果表明:H-FABP、E-FABP基因在鹿不同组织中均有表达,且在同种鹿的不同组织和不同鹿种的同一组织间均存在差异。H-FABP基因在心中表达量显著高于其他组织(P<0.05),而在肺、肝的表达量显著低于其他组织(P<0.05);E-FABP基因在皮下脂肪中表达量显著高于其他组织(P<0.05),而在心、肝、肋间肌和臀大肌的表达量较低;H-FABP、E-FABP基因表达量的高低还与鹿的性别、种类有关。

Ghrelin在马鹿器官组织中的表达

为研究Ghrelin在马鹿体内可能表达的器官,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法检测马鹿的舌、食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肝、胰、颌下腺、腮腺、气管、肺、肾、输尿管、膀胱、卵巢、输卵管、子宫、阴道、大脑、下丘脑、垂体、松果体、甲状腺、肾上腺、心肌、心内膜、脾、淋巴结和骨骼肌中Ghrelin表达情况。结果显示,Ghrelin在皱胃内的表达量明显高于其他器官(P<0.05);胰、子宫、卵巢、十二指肠和食管次之,与其余30种器官的表达量相比差异也显著(P<0.05);其余器官内的表达量相对较少。结论:Ghrelin在所检测的36种器官内均有表达。

鹿茸及鹿血中布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可应用于快速检测鹿茸及鹿血中布鲁氏菌的方法,保证鹿产品的药用、食用安全,试验根据布鲁氏菌特异性基因IS711设计合成引物和探针,建立实时荧光定量PCR方法,对反应条件进行优化,并绘制标准动力学曲线,Y=-3.14X+37.62,R^(2)=0.997。结果表明:该方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,组内、组间重复性试验Ct值标准差小于0.5,变异系数均小于2%,最小检测拷贝数为2.65×10^(1)Copies/μL。该方法对目的基因检测灵敏度高,可用于鹿茸及鹿血相关样本的检测,也可用于布鲁氏菌的定性和定量检测,为相关鹿产品的质量安全评估提供重要技术保障。

塔里木马鹿维生素D受体（VDR）基因结构和功能的预测与分析

为了分析塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)维生素D受体(VDR)基因的结构和相关功能,本研究从前期研究获得的塔里木马鹿和天山马鹿(C. e. songaricus)皮肤组织转录组测序结果中,获得上调表达的塔里木马鹿VDR基因的序列,对塔里木马鹿VDR基因进行实时荧光定量PCR(qPCR)验证,利用相关软件进行同源性比对、系统进化树构建和生物信息学分析。实时荧光定量PCR结果显示,VDR基因在转录组测序的结果与qPCR的结果中表达趋势一致,均为上调。基于VDR基因同源性比对结果显示,塔里木马鹿与白尾鹿(Odocoileus virginianus,GenBank登录号XM_020889235.1)的遗传距离较近,同源性最高;与褐家鼠(Rattus norvegicus,GenBank登录号NM_017058.1)的遗传距离较远,同源性最低。系统进化树也证实了这个结果。生物信息学分析结果表明,塔里木马鹿VDR蛋白由20种氨基酸组成,分子质量为32.92 ku,理论等电点为5.73,不稳定系数为33.56,总平均亲水性为﹣0.298,脂溶系数94.95,无跨膜区,无信号肽,无O-糖基化位点,有1个N-糖基化位点,有15个磷酸化位点,最有可能位于内质网膜中,二级结构和三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,有3个低复杂度区域,无保守结构区域。

东北狍PTN基因cDNA克隆及表达分析

采用RT-PCR方法、分子克隆技术成功获得东北狍(Capreolus pygargus)PTN(pleiotrophin)基因cDNA序列。结果表明:获得的PTN基因cDNA序列长750 bp,共编码167个氨基酸,PTN蛋白分子质量为18.9 ku,理论等电点(pI)为9.66,是信号肽介导的一种亲水性蛋白质,其二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋和β-折叠,分别占46.71%、32.34%和20.96%;生物信息分析发现,东北狍PTN基因在进化上较为保守,与其他物种同源性均>89%;构建的进化树表明,东北狍PTN基因与野牦牛、绵羊、野猪等偶蹄目动物亲缘关系较近,这一结果符合经典分类学规律;实时荧光定量RT-PCR分析显示,PTN基因在狍茸顶端组织不同生长层表达量存在显著差异,其中前软骨和间充质组织层的表达量明显高于皮肤和软骨组织层。

梅花鹿MRFAP1基因的编码区克隆及表达分析

为了探索梅花鹿MRFAP1基因的结构与生物学功能及其在梅花鹿鹿茸顶端间充质组织生长前中后期的表达差异,揭示MRFAP1对鹿茸生长重要的生物学意义,试验采用分子克隆技术成功获得了梅花鹿MRFAP1基因cDNA序列,根据梅花鹿MRFAP1基因cDNA序列,展开生物信息分析和梅花鹿鹿茸顶端间充质组织各生长阶段表达差异的研究。结果表明:获得的MRFAP1基因cDNA序列长532 bp,共编码127个氨基酸;梅花鹿MRFAP1蛋白是一种亲水不具跨膜结构的脂溶性不稳定蛋白分子,相对分子质量为14707.65;理论等电点(pI)为4.64;主要由α-螺旋组成,其次为无规卷曲。梅花鹿MRFAP1氨基酸序列与牛、东北虎、野猪相似性较高,而且MRFAP1基因在进化中高度保守;在梅花鹿鹿茸顶端间充质组织各生长阶段的表达量存在显著差异,其中在间充质组织生长前期表达量最高,中期表达量最低,前期的表达量是中期的(3.710±0.010)倍。说明成功克隆了梅花鹿MRFAP1基因,并分析得出MRFAP1基因在梅花鹿鹿茸顶端间充质组织各生长阶段的表达量规律为前期>中期>后期。