基于病菌孢子捕捉和real-time PCR技术的田间空气中小麦白粉病菌孢子动态监测及病情估计模型研究

利用Burkard定容式孢子捕捉器结合real-time PCR定量技术,分别对种植高抗、中感和高感白粉病小麦品种的田间空气中白粉病菌分生孢子浓度进行监测,结果表明,real-time PCR定量与传统的显微观察计数两种方法测得的孢子浓度呈显著正相关(P≤0.01),且两种病菌孢子计数方法在同一抗性品种上监测到的孢子浓度动态相近。此外,两种方法测得的孢子浓度与各气象因子的相关性分析结果一致,空气中的白粉病菌孢子浓度主要与空气相对湿度显著正相关。在此基础上,利用两种方法测定的田间空气中白粉病菌孢子浓度分别建立了基于累积孢子浓度的田间病情估计模型。分析发现,基于两种孢子浓度测定方法建立的病情估计模型间无显著性差异,表明real-time PCR定量技术测定的孢子浓度在构建白粉病病情估计模型上具有一定可行性。该结果为real-time PCR定量技术与病菌孢子捕捉技术相结合用于小麦白粉病的监测和预测提供理论依据。

基于Real-time PCR法检测乳粉中牛源性成分定量研究

基于Real-timePCR建立了乳粉中牛源性成分相对定量检测方法,并对牛的特异性引物与探针进行了特异性、灵敏度和稳定性测试。通过模拟不同浓度牛乳粉与马乳粉混合样本,根据其△Ct值的函数关系进行线性拟合进而绘制标准曲线,建立乳粉中牛源性成分的相对定量检测。结果显示,该方法的最低检测限为0.00001 mg/mL,回收率为91.11%~119.2%,组间变异系数≤0.58%、组内变异系数≤1.44%。说明该方法在特异性与稳定性上适用于乳粉中牛源性成分及含量的掺假检测。

一种基于real-time PCR技术的TTV检测方法的建立及应用

目的:本研究旨在开发一种具有更高灵敏度和特异性的TTV检测技术,为揭示TTV在多种疾病过程中的作用提供重要的技术支持。方法:为了更精确、灵敏的检测TTV,本研究分析了目前公布的所有亚型的TTV基因序列,在此基础上建立了一种基于UTR区域的real-time PCR检测方法,并与文献报道应用较为广泛的PCR检测方法进行了对比。结果:本研究建立的方法在1×10^(7)~1×10^(1) copies/μL标准品浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为1.000,斜率为-3.446,检测下限为1×10^(1) copies/μL。重复性试验结果显示,组内变异系数为7.22%,表明本方法重复性、稳定性较强。针对30份临床样本,使用本研究建立的real-time PCR检测方法及目前被多个研究所使用的4套引物进行对比。结果表明,本研究所建立的方法灵敏度显著高于文献中报道的4种方法(P<0.01);Sanger测序结果表明,本方法检测出的30份阳性样本均为TTV,检测特异性为100%。结论:本研究采用基于TaqMan探针的real-time PCR检测方法,检测灵敏性高、覆盖基因型范围广,尤其对于TTV病毒载量较低的情况下能够进行定量检测,对于TTV病毒的致病性及作为免疫标志物的应用提供重要的技术支持。

24重荧光real-time PCR技术在食物中毒快速检测中的应用

目的:应用24重荧光real-time PCR检测技术快速筛检食物中毒病原菌,结合国家标准中的培养法探讨24重荧光real-time PCR检测技术符合性和应用价值。方法:采用高灵敏度、高特异性的24重荧光real-time PCR检测技术作为中毒病原菌的初筛方法,国标方法进行细菌分离培养,并对分离出的病原菌进行生化鉴定。结果:5份食物中毒患者肛拭子在增菌前检出4份霍乱弧菌核酸(非O1/非O139群,24重荧光real-time PCR),9份患者肛拭子在增菌后检出5株霍乱弧菌(非O1/非O139群,国标培养法),其中包含4份PCR技术初筛阳性样品,两个方法的符合率为80%。所有样本均未检出沙门氏菌、志贺菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠埃希菌以及金黄色葡萄球菌。结论:应用24重荧光real-time PCR检测技术同时检测24种常见致病病原菌,能高效锁定中毒病原菌。将其与国标培养法相结合,对临床治疗和食物中毒快速处置能起到积极作用,值得应用和推广。

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA(Accession EF172428),根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%-7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。

猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物,构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验,成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染后的猪肺组织中NLRP3表达水平。最佳引物浓度为0.15μmol/L,建立的标准曲线方程为y=-3.5196x+36.968,E值为0.96,最低检测量为84个拷贝,熔解曲线有单一峰,批内变异系数CV为0.067%~0.184%,批间变异系数为0.221%~0.594%,重复性好。该方法检测仔猪在感染Mhp后肺组织中的NLRP3 mRNA表达水平,感染组与健康组相比差异显著(P<0.01),NLRP3表达水平明显增高,在感染后14 d可达到高峰,平均mRNA拷贝数达18000左右,可持续42 d。表明该检测方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的激活及其相关炎症反应机制提供了技术支持。

多主棒孢SdhB-H278Y突变位点real-time PCR检测体系的建立与应用

根据GenBank已登录序列中黄瓜多主棒孢琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)基因序列差异,针对SdhB-H278Y突变设计特异性引物,建立SdhB-H278Y突变实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系。结果表明:供试多主棒孢携带SdhBH278Y、SdhB-I280V突变;SdhB-H278Y突变株对啶酰菌胺抗性较强,EC50值为21.47μg·mL^(-1)或>30μg·mL^(-1);建立的real-time PCR检测体系具有良好的线性关系,相关系数R2=0.9929,可特异性检测SdhB-H278Y突变,灵敏度为3.6×10^(-4) ng·μL^(-1),为AS-PCR的10倍。利用携带SdhB-H278Y突变不同比例的基因组DNA对检测体系进行验证,预期值与检测值具有很高的相关性,R^(2)=0.9997;利用该检测体系对山东地区黄瓜棒孢叶斑病病斑中多主棒孢SdhB-H278Y突变株所占比例进行检测,检测结果为0.12%~2.69%。综上,本试验建立的real-time PCR检测体系高效、灵敏、定量,可用于多主棒孢SdhB-H278Y突变的检测,为黄瓜棒孢叶斑病抗性治理提供技术支持。

羊肉中貉源成分Real-time PCR检测方法的建立

[目的]检测羊肉中是否含有貉肉成分。[方法]通过实时荧光定量PCR方法,以cytB为靶基因设计特异性检测引物,选取8个不同物种的肌肉组织样本为研究对象,根据其ΔCt值函数关系进行线性拟合建立标准曲线。[结果]该检测方法所用引物能将貉与其他物种区分,特异性较强,且最低检测限可达到3.2 pg/μL,回收率在97.71%~104.36%,组内变异系数≤0.28%,组间变异系数≤1.08%。[结论]该研究建立的羊肉中貉肉源成分实时荧光定量检测方法具有良好的特异性和敏感性,可用该方法检测实际羊肉样品中是否有貉肉源成分,为羊肉制品掺假的检测提供简单快捷准确的技术手段和执法依据。

Real-time PCR和PCR方法快速检测犬细小病毒

为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法。通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著提高。通过对大量不同采样部位样品的检测证实,本研究建立的Real-time PCR和PCR方法具有较高的可靠性,并可显著提高CPV的阳性检出率。

Real Time PCR研究进展及其在海洋病原生物检测中的应用

Real Time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,目前已广泛应用于分子生物学研究的各个领域。Real Time PCR技术秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等优点,同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等缺点,无需在反应结束后通过电泳操作确认扩增产物。目前,Real Time PCR可设计多对引物在同一反应体系中同时对多个靶基因进行扩增,实现多重实时定量检测。Real Time PCR使PCR技术发生了质的飞跃,扩展了PCR技术的应用范畴,是一种具有划时代意义的技术。本文主要介绍Real Time PCR的主要原理、解析方法、技术发展趋势及其在海洋病原生物检测方面的应用。

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用

为了建立和应用可检测基因I型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的荧光定量检测方法，实验根据基因I型GCRV的s6保守序列，分别设计扩增目的条带661bp普通引物（P1、P2）、扩增目的条带159bp荧光定量引物（F1、F2）和一条探针；同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒，10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线（Y=-3．389X＋38．076）。结果表明，此方法在3．9×10^7～3．9×10^1拷贝／uL之间相关性较好，R2为0．992，最小检测量为4拷贝／uL；且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品，阳性结果为4份；而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因I型GCRV的荧光定量检测方法，具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点，适合于目前基因I型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。

金黄色葡萄球菌基因表达的DNA扣除法Real-time RT PCR相对定量分析

【目的】金黄色葡萄球菌作为一种分布广泛的致病微生物和研究革兰氏阳性菌遗传背景的模式菌株,利用real-time RT PCR对相关毒素及调控基因进行表达定量分析,在生物、医学、食品检测等领域具有较大研究价值。【方法】对制备好的反转录(RT,含有cDNA和DNA)和非反转录(RT—,仅含DNA)样品进行Real-time PCR检测,根据经典(1+E)—△△Ct相对定量算法并结合PCR效率公式建立一种基因表达相对定量分析的DNA扣除法,将得到的Ct值转换为各样品含量,从RT样品中扣除RT—样品的量,无需DNaseⅠ酶解处理就可以去除DNA的影响,RT—样品的检测结果还可同时作为稳定的DNA内参。【结果】采用以上方法分析金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(sea)、16S rRNA和RNAⅢ的表达情况,在含有葡萄糖的NB培养基中sea的相对转录水平随着葡萄糖浓度的增大而升高,RNAⅢ的相对转录水平随葡萄糖浓度的变化而产生小幅度的波动,16S rRNA在菌体生长初期时的表达量较为稳定;与绝对定量法比较,结果差异较小(均小于15%),且差异不显著(p>0.05)。【结论】这种基于DNA扣除法的Real-time RT PCR相对定量方法可以有效的对金黄色葡萄球菌的基因表达进行分析。

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。

荧光Real-time PCR鉴定鸡胸骨总RNA质量

为了更准确地鉴定提取鸡骨总RNA的质量,试验分别用核酸蛋白检测仪、1%琼脂糖凝胶电泳和荧光Real-time PCR检测评价3种不同的方法提取成年鸡胸骨总RNA的质量。结果显示,荧光Real-time PCR可更好地鉴定提取的骨总RNA的质量。用核酸蛋白检测仪、1%琼脂糖凝胶电泳能粗略检测RNA的纯度和完整性,但不能反映提取过程中是否引起基因不均一的减少,所检测的纯度也不能精确反映RNA的反转录效率。

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法。方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100+NP40、Chelex-100+TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度。结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100+NP40法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度。结论:Chelex-100+NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR。

Real-time TaqMan RT-PCR快速检测犬瘟热病毒方法的研究

按照犬瘟热(CDV)N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real-time荧光定量RT-PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用建立的Real-time荧光定量RT-PCR方法与常规RT-PCR以及韩国BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测。结果:用20pmol/mL的引物浓度各1uL和20pmol/mL的探针浓度0．3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感性高,可检测到1．24×10—3ng/uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数(CV)分别为2．3%、2．5%和4．2%;与常规RT-PCR和BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。

转基因番茄植株Mi1.2表达水平的Real Time PCR检测体系的建立

[目的]为转基因番茄植株的高通量筛选奠定基础。[方法]利用CTAB法提取番茄叶片总RNA进行Real Time PCR扩增，分析转MI1、2基因的番茄植株表达水平的检测体系。[结果]提取RNA的A260／A280为1．78～1．88，RNA无明显降解。在严谨扩增条件下，引物SYBR2的扩增效率高于SYBR1。Mg^2＋的适宜浓度为2．0mg／L。Real Time PCR扩增产物具有良好的特异性，熔解曲线特异峰出现在84．5℃附近，在熔解曲线略低于83℃附近有极微弱的非特异峰。因此在定量反应中信号检测步骤应放在84℃。以4种不同模板分子数条件下扩增曲线Ct值得到的回归方程为Y=-3．78×log（copynumber）＋39．50，相关系数为0．998。[结论]该试验获得的Real Time PCR体系可用于转基因植株表达水平的检测。

Real-time PCR及预测微生物学在白酒酿造中的应用构想

利用实时荧光定量PCR技术及预测微生物学建立可培养酿酒微生物资源数据库和预测微生物学数学模型,可探究在白酒酿造过程中可培养酿酒微生物的变化规律及不同环境因素对可培养酿酒微生物菌群变化的影响,为白酒酿造工艺优化提供重要参数。

检测粪便中GGⅡ型诺如病毒Real-time RT-PCR方法的建立

诺如病毒是世界急性胃肠炎的重要病原之一。为加强其控制，通过序列比对设计出针对GGⅡ型诺如病毒保守序列的特异性引物与探针，建立了TaqMan Real-time RT-PCR方法。结果显示，此方法对诺如病毒核酸检测高度特异，与轮状病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒等无交叉反应，最低检出限可达10^2拷贝，线性范围为100～100拷贝，标准曲线的相关系数为-1．00。针对标准品质粒检测的批内实验变异系数为0．28％～1．63％（n=6）、批间实验为0．28％～1．05％（n=3），对同一样品分6次进行RNA提取和逆转录，其变异系数为3增8％。对212份临床腹泻标本分别用常规RT-PCR和本文建立的TaqMan Real-time PCR进行检测，发现后者检出率略高于前者。这些结果提示此研究建立的诺如病毒的TaqMan Real-time RT-PCR检测方法可用于临床腹泻粪便标本的检测。