实时荧光定量PCR检测柞蚕微孢子虫的方法

提高柞蚕微孢子虫检测技术的准确性和灵敏度,对控制柞蚕微孢子虫的胚种传染至关重要。以柞蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(SSU rRNA)基因为靶基因,建立柞蚕微孢子虫的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法能够特异性检测柞蚕微孢子虫基因组DNA,而对柞蚕基因组DNA无扩增产物。依据标准曲线确定荧光定量PCR的Ct值≤35作为检测的敏感度区间,对柞蚕微孢子虫基因组DNA的最低检出限为0.004 6 ng。应用该方法对100粒柞蚕蛹样本进行检测,共检出54个样本呈柞蚕微孢子虫感染阳性,而采用普通显微镜镜检与采用常规PCR方法检测呈阳性的样本数量分别为2个和34个。应用该方法对生产中的柞蚕种茧和雌蛾进行抽样检测,柞蚕微孢子虫感染阳性检出率显著高于用普通显微镜镜检的阳性检出率(P<0.05)。建立的柞蚕微孢子虫实时荧光定量PCR检测方法提高了检测的灵敏度。

基于LiCl法优化酿酒葡萄叶片的RNA提取

为获得纯度高、质量好的酿酒葡萄植株叶片RNA以用于荧光实时定量分析,为后续以酿酒葡萄叶片RNA为材料研究相关转录水平的调控提供技术保障,以经典酿酒葡萄赤霞珠叶片为试验材料,比较分析了重蒸酚法、Trizol法、改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和LiCl法(基于改良的SDS法)4种方法对酿酒葡萄叶片RNA提取的影响。结果表明,重蒸酚法提取RNA浓度较低,完整性较差,存在部分降解;Trizol法提取的RNA则有部分DNA污染;改良CTAB法提取浓度较高,但蛋白和DNA污染严重;LiCl法提取结果显示,28S的条带亮度是18S的2倍,条带无拖尾,完整性较好,存在DNA污染和少量的蛋白污染。进一步在LiCl法基础上利用醋酸钠、DNAase消化、苯酚抽提法进一步优化,并采用荧光实时定量验证,结果表明,醋酸钠的加入RNA质量无明显改善;然而,经氯仿和水饱和酚(体积比1∶1)抽提2次,氯仿抽提1次,氯仿和水饱和酚(体积比1∶1)抽提1次,并经DNAase进行消化,最终提取出质量浓度为173.611μg/mL、A_(260/280)为1.803纯度高、完整性较好且无蛋白和DNA污染的葡萄叶片总RNA;经实时荧光定量PCR进一步验证,该方法提取的RNA经反转录后获得较好的扩增曲线以及融解曲线,并能够对相关基因进行定量分析。

HLA-GmRNA在肝癌患者外周血单个核细胞中的表达及意义

目的：了解肝细胞癌（HCC）患者外周血单个核细胞（PBMC）、人类白细胞抗原 G mRNA（HLA-G mRNA）的表达水平及其意义。方法收集44例 HCC患者、21例肝硬化患者和40例健康查体者的 PBMC，建立逆转录-实时荧光 PCR相对定量体系检测PBMC HLA-G mRNA相对表达量。结果 HCC组、肝硬化组和健康对照组的 HLA-G mRNA相对表达量分别为1.71±0.39，1.05±0.38和1.01±0.47，HCC组高于肝硬化组和对照组，差异有统计学意义（F＝33.657，P＜0.001）。HLA-G mRNA高表达的 HCC患者生存率低于 HLA-G mRNA低表达者，差异有统计学意义（χ2＝5.972，P＝0.015）。结论 PBMC HLA-G mRNA相对表达量与肝癌发生发展密切相关，检测 PBMC HLA-G mRNA有助于肝癌的诊断与研究。

种子传播黄龙病可能性研究

【目的】探讨带菌种子能否传播黄龙病,为黄龙病防控策略的制定提供科学依据。【方法】采用单管双引物对Taq Man探针实时荧光定量PCR(STDP-q PCR)对从感染黄龙病沙田柚树上收集的种子进行黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asi-aticus,Las)检测,观察播种的沙田柚种子萌发生长情况,并用STDP-q PCR对萌发的幼苗进行Las检测。【结果】两份种子样品均能检测到Las。播种的108颗种子共萌发91颗(84.3%),部分沙田柚苗在生长初期表现叶片畸形或黄化症状,但随后恢复正常。由种子萌发而来的沙田柚苗经30、60、90、180和360 d生长后取样检测,均未检测出Las。【结论】黄龙病通过带菌种子进行传播缺乏证据。

肉碱棕榈酰基转移酶2过表达载体构建及在奶牛乳腺上皮细胞中验证

为进一步研究CPT2基因在脂质代谢中的作用,试验构建了绿色荧光CPT2过表达载体,将其转入奶牛乳腺上皮细胞,通过荧光定量方法,检测CPT2基因mRNA的表达水平差异,在细胞水平验证了CPT2过表达载体的表达效率。结果表明:过表达组的CPT2基因mRNA表达量与对照组(空载组)相比有所提高。说明CPT2过表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞后,CPT2基因mRNA表达水平显著升高。

甲醛在有无苯作用下对细胞因子M-CSF、G-CSF和EPO转录的影响

研究了甲醛在有无苯作用下对3种细胞因子巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)和促红细胞生成素(EPO)转录水平的影响。将30只雄性BALA/c小鼠随机分成5组,设为空白对照组、玉米油对照组、苯染毒组、甲醛染毒组、苯与甲醛联合染毒组,每组6只,分别进行玉米油溶液、苯溶液灌胃染毒或甲醛气态吸入染毒;染毒时间模拟工厂工作时间,每天8h,连续两周,第6d、第7d休息,第13d染毒结束;取小鼠的骨髓和肾脏,提取其总RNA,并用实时荧光定量PCR技术对细胞因子M-CSF、G-CSF和EPO转录水平的变化进行检测。结果表明,甲醛单独作用可使M-CSF、G-CSF、EPO的转录水平下降;与苯联合后,苯加强了甲醛对M-CSF转录水平的影响、削弱了甲醛对G-CSF和EPO转录水平的影响。

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及增殖规律

为了研究猪流行性腹泻病毒（PEDV）的生长规律，利用Vero细胞从四川腹泻仔猪小肠内容物中分离得到1株病毒，经RT—PCR检测、序列比对、病毒理化试验与微量中和试验证实该分离株为猪流行性腹泻病毒，命名为SC—P，以该毒株经口接种28日龄仔猪，5d后出现明显临床症状。以SC—P分离株感染Vero细胞，收集不同时间的细胞上清，利用建立的PEDV荧光定量检测方法对不同时间点样品中病毒RNA进行定量分析，绘制PEDV的一步生长曲线。结果显示，细胞外的病毒RNA含量呈S形曲线增长，感染后第2～6小时，病毒RNA含量的增长较慢，第6～24小时呈对数增长，第24～72小时增长速度减缓，维持在较高水平，进入稳定期。表明PEDV感染Vero细胞，病毒在细胞内增殖到达一定数量以后，便逐步向胞外释出。

发酵乳酸杆菌F6对鸡小肠上皮细胞β-防御素-9基因表达的影响

采用实时荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)检测益生性发酵乳酸杆菌F6刺激鸡小肠上皮细胞后抗菌肽β-防御素-9(AvBD9)基因表达变化,为从益生菌与上皮细胞抗菌肽表达关系的新角度解析益生菌发挥益生作用的新途径和机制提供一定的基础及依据。利用不同剂量(2×105,2×106,2×107 CFU)的发酵乳酸杆菌F6分别刺激原代培养的鸡小肠上皮细胞4h,提取刺激后的细胞总RNA,反转录为cDNA,FQ-PCR检测抗菌肽AvBD9基因表达变化。结果表明,未受刺激的正常对照组也检测到AvBD9mRNA的表达,发酵乳酸杆菌F6能上调AvBD9基因表达。刺激组中AvBD9mRNA的表达在不同剂量组之间存在差异。2×105 CFU/mL组AvBD9mRNA的表达量极显著高于未受细菌刺激的对照组和2×106 CFU/mL组(P<0.01),显著高于2×107 CFU/mL组(P<0.05)。2×106 CFU/mL组和2×107 CFU/mL组AvBD9mRNA的表达量显著高于未受细菌刺激的对照组(P<0.05),但2×106 CFU/mL组和2×107 CFU/mL组之间无显著差异(P>0.05)。发酵乳杆菌F6与鸡小肠上皮细胞相互作用过程中可提高抗菌肽AvBD9mRNA的表达,且存在剂量依赖性。