16S rDNA和recA-gene对乳酸菌Ⅱ32的鉴定

对乳酸菌Ⅱ32进行了生化实验.以菌株Ⅱ32的总DNA为模板,采用细菌通用的引物,对其16S rDNA进行特异扩增,并进行序列测定,将测定结果与GenBank DNA数据库中已知菌种的16S rDNA序列通过BLAST软件进行分析比较,初步确定该菌株为戊糖乳酸菌、植物乳杆菌或类植物乳杆菌.采用recA-gene约300bp的特异扩增片段最终确定乳酸菌Ⅱ32为类植物乳杆菌.

质粒的复制特性和整合后在发动大肠杆菌染色体复制中对recA基因的依赖性的研究

大肠杆菌的温度敏感的DNA复制发动突变型dnaA46在42℃中不能生长而形成菌落,质粒或噬菌体的整合使它能生长。前文[2]报道了F质粒整合后所发动的染色体复制依赖于recA基因。本文报道5种质粒和2种噬菌体整合后所发动的染色体复制对recA基因的依赖性的研究结果。实验结果说明,依赖与否和它们在游离状态中复制方向无关,从而否定了recA基因的作用是把质粒或噬菌体的游离状态的单向复制发动机构改变为整合状态的双向复制发动饥构这一假设。

绿脓杆菌外毒素ArecA基因的融合及融合蛋白的表达

将绿脓杆菌ｒｅｃＡ基因克隆到ｐＵＣ１８中，构建了中间载体ｐＵＣＲ１８；然后以正确的向位及阅读框架将ｒｅｃＡ基因亚克隆到毒性基因缺失的绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因中，构建了ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因质粒ｐＥＲＡ；融合基因经ＢａｍＨＩ及ＥｃｏＲＩ酶切，以正确阅读框架插入带有Ｔ７表达启动子的质粒ｐＥＴ－１７ｂ，构建了可表达ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因的质粒ｐＥＲＡ－１７ｂ。经酶切分析及ＰＣＲ扩增检测证明，绿脓杆菌ｒｅｃＡ已插入ＰＥＡ毒性基因中。ｐＥＲＡ－１７ｂ转化到ＤＥ３溶原态大肠杆菌ＨＭＳ１７４中，经ＩＰＴＧ诱导，表达了ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和凝胶薄层扫描ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白，表明ＰＥＡ－ＲｅｃＡ的分子量约为９００００，与理论推算相符，表达率占菌体总蛋白量３．４２９％，用ＰＥＡ抗血清和抗ＲｅｃＡ单克隆抗体作免疫印迹分析。

牛分枝杆菌RecA基因的克隆与序列分析

以牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Vallee111株染色体DNA为模板,以RecA基因特异性引物进行PCR扩增,获得约240 bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出了重组质粒pMDTM18-T-RecA,为进一步研究RecA基因及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础。

recA基因的克隆及其在λ溶原菌中的生物学功能

通过一对自行设计的引物,以E.coli染色体DNA为模板进行PCR扩增,获得完整的recA基因。将PCR产物和pUC18在体外进行连接后,并分别转入E.coliDH5α和E.colik12(λ+),筛选出含重组质粒(pUR4)的转化子。在诱导条件和非诱导条件下,分别测定recA基因在不同转化子中的生物学功能。结果表明recA基因在溶原菌中表现出明显的生理功能,能使λ原噬菌体从溶原状态进入裂解循环。这种重组质粒将在进一步研究λ原噬菌体的诱导机理以及受紫外辐射损伤细胞的修复作用等方面成为有效的工具。

2株禽源鲍曼不动杆菌recA及16S rRNA基因的序列分析

为了解禽源鲍曼不动杆菌与已知同种异源菌株的差异性,基于管家基因recA (同源重组因子A基因)并结合16SrRNA基因对2株禽源鲍曼不动杆菌分离株进行系统发育分析。结果表明:分离株序列同源性与鲍曼不动杆菌的同源性最高,高达92.0%～99.9%,且与人源鲍曼不动杆菌遗传距离最近,证实了recA基因与16SrRNA基因在鉴定鲍曼不动杆菌属菌种上的正确性。这一研究提示,分离自禽的鲍曼不动杆菌在基因演化上可能源自于人类。

RecA蛋白介导的小粒野生稻STK类抗性基因富集文库的构建

利用RecA蛋白的同源重组特性,以生物素标记的STK类抗性基因PCR扩增产物为探针,对小粒野生稻DNA文库进行富集,构建了库容量为1 710个的STK类抗性基因富集文库,通过菌落原位杂交筛选获得21个阳性克隆.其中10个阳性克隆进行了两端测序,生物信息学分析表明:有3个阳性克隆可分别定位于粳稻抗性基因附近和抗性基因内,可能是新的候选抗性基因;有2个阳性克隆可以在粳稻上定位,但周围无抗性基因片段;其它5个阳性克隆由于与栽培稻有多处匹配,不能精确定位。

鸭疫里默氏杆菌recA基因突变对其生长及DNA损伤反应的影响

DNA损伤反应(SOS response)是细菌应对基因组DNA损伤的一种重要的保护机制。RecA蛋白在许多细菌中对SOS反应的诱导都起关键调控作用,其同源蛋白广泛存在于各种生物体中。本研究对鸭疫里默氏杆菌RecA蛋白是否调控其SOS反应进行探索。构建recA基因缺失株和回复株,检测亲本株、缺失株和回复株在紫外线辐照损伤下的生长能力、recA基因的转录水平以及SOS反应。结果表明,成功构建了recA基因缺失株ΔrecA和回复株cΔrecA;recA基因灭活对鸭疫里默氏杆菌RA-GD株的生长速率无明显影响;在紫外线辐照损伤下,亲本株recA基因的转录水平明显升高,缺失株的存活能力及其基因组的完整性都显著低于亲本株和回复株。本研究证实RecA蛋白参与鸭疫里默氏杆菌的SOS反应。

RecA蛋白-互补单链DNA探针提高压电基因传感器灵敏度的实验研究

目的研究利用RecA蛋白-互补单链DNA探针与固定的肽核酸(bis-PNA)探针相结合提高压电基因传感器的灵敏度的可行性。方法基因传感器阵列固定上针对乙肝病毒的bis-PNA探针,加入靶DNA与之反应,然后加入预先处理过的的RecA蛋白-互补单链DNA探针。结果直接加入靶DNA所引起的频率改变为15.83±7.31Hz,反应时间为45.16±12.87min,加入RecA蛋白-互补单链DNA探针(浓度为3.0mg/ml),所引起的频率改变最为明显,为112.16±12.7Hz。结论在反应体系中加入RecA蛋白-互补单链DNA探针,能有效地提高压电基因传感器的灵敏度,明显缩短反应体系时间。

乳酸菌素生产菌的分离与鉴定

对乳酸菌素产生菌进行分离,得到4株理想菌株。利用高效液相色谱检测其发酵液,初步确定4菌株均为乳酸菌,其中Ⅱ32菌株产乳酸最多,对各指示菌的抑制作用最显著,对该菌株作进一步的研究。Ⅱ32菌株在MRS培养基上可以生长,最适生长温度为28℃,革兰氏染色呈阳性,无芽孢。通过API生化反应实验、16SrDNA测序可进一步确定该菌株是L·paraplantarum或L·paraplantarum。最终通过对recA-gen的PCR产物检测,鉴定菌株Ⅱ32为Lactobacillusparaplantarum(类植物乳杆菌)。牛津杯抑菌试验显示,该菌株的发酵液不仅对多数G+细菌的生长有较强的抑制作用,而且对大肠杆菌、沙门氏菌等Gˉ细菌的生长也具有明显的抑制作用,但对真菌没有活性。

四川牦牛奶和曲拉中九株乳酸菌的分子鉴定

为准确鉴定分离自我国四川鲜牦牛奶和曲拉中9株乳酸菌到种水平,作者运用16S rDNA序列分析、recA基因特异扩增和hsp60-RFLP等多种分子技术对分离自我国四川地区鲜牦牛奶和曲拉中的9株乳酸菌进行分类鉴定。结果证实,16S rDNA序列分析法可将9株乳酸菌初步归类为植物乳杆菌群(4株),肠膜明串珠菌(4株),瑞士乳杆菌(1株)。由于16S rDNA序列分析法不能区分植物乳杆菌和戊糖乳杆菌,为了进一步鉴定植物乳杆菌群中的4株菌,继续采用recA基因特异扩增和hsp60-RFLP技术对其细分,结果表明recA基因特异扩增和hsp60-RFLP的方法均能很好地把植物乳杆菌群中的4株菌鉴定到种水平,且均为植物乳杆菌。

洋葱伯克霍尔德氏菌株Lyc2的鉴定及对棉苗的防病促生作用

从烟草根际土壤中分离到一株细菌菌株Lyc2,平皿对峙培养显示该菌可显著抑制多种植物病原真菌菌丝体的生长。温室盆栽试验表明,Lyc2对棉花苗期立枯病的防治效果达到48.8%;水培棉花苗试验表明,Lyc2能显著增加棉苗的鲜重和干重,但对株高的影响不显著。该菌经形态、生理生化试验测定及16S rDNA和ITS序列分析,初步确定为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia);进一步通过种特异的recA基因序列分析,证明Lyc2菌株属于B. cepacia复合物中基因型IX,B.pyrrocinia。

牛分枝杆菌特异性基因的PCR扩增及二联PCR反应的建立

为了研究牛结核病的PCR诊断方法,本研究以牛分枝杆菌(M.bovis) Vallee111株染色体DNA为模板,以RecA和Pps1基因特异性引物进行PCR扩增,获得约860bp和430bp的DNA片段。将PCR纯化产物进行测序,通过BLAST序列分析,与GenBank中登录的M.bovis AF2122/97 RecA基因和Pps1基因的核苷酸序列同源性均达到99%。在同一PCR反应中同时加入RecA和Pps1基因特异性引物建立RecA-Pps1二联PCR反应。同时,RecA和Pps1PCR扩增的敏感性分别达到585fg和195fg,特异性均达到100%,为进一步研究RecA和Pps1基因以及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础。

槟榔植原体膜蛋白基因的克隆及其抗血清制备

根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因(Ac Pmp)序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP,以病样槟榔总DNA为模板扩增该Ac Pmp的编码区并连接到p MD19T simple中间载体。将测序正确的阳性菌提取质粒p MD19T-Ac Pmp,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收Ac Pmp片段,然后以正确的编码框连接到原核表达载体p ET32a(+),转化Escherichia coli BL21感受态细胞。含有p ET32a-Ac Pmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,在30℃,0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h,可产生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔,取其抗血清,以融合蛋白(1∶10 000稀释)作抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。

牛分枝杆菌三重PCR检测方法的建立

为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的三重PCR方法,本研究以M.bovis ValleeⅢ株染色体DNA为模板,分别以其recA、IS6110、IS1081基因特异性引物进行PCR扩增,建立检测M.bovis的recA-IS6110-IS1081三重PCR反应。通过PCR扩增获得大小约为860 bp、520 bp和340 bp的DNA片段。BLAST序列分析表明,这3个基因片段与GenBank中登录的相关基因的核苷酸序列同源性均达到99%。同时,recA、IS6110和IS1081PCR扩增的敏感性分别达到585 fg、19.5 fg和19.5 fg。特异性较强,只有M.bovis和人结核临床分离株扩增反应为阳性,为进一步研究recA、IS6110和IS1081基因以及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础。

快速检测洋葱伯克霍尔德菌巢式荧光定量PCR法建立

目的建立能直接快速应用于临床检测洋葱伯克霍尔德菌的巢式荧光定量PCR法。方法根据洋葱伯克霍尔德菌recA基因序列设计用于普通PCR扩增的外引物,同时设计用于荧光定量PCR的内引物。分别以洋葱伯克霍尔德菌等细菌的标准株为模板,以外引物进行第一轮PCR扩增;所得PCR产物为模板,以内引物进行染料法荧光定量PCR检测recA基因表达水平,评估巢式荧光定量PCR法的特异性。同时将洋葱伯克霍尔德菌的菌液和基因组DNA进行浓度梯度稀释,继续进行巢式荧光定量PCR,确定此方法的灵敏度。最后用巢式荧光定量PCR法和Vitek 2 Compact仪器分别鉴定35例临床标本,比较两者的检出能力。结果巢式荧光定量PCR法只针对洋葱伯克霍尔德菌有扩增曲线,而对其他菌株无检测信号。同时,巢式荧光定量PCR法的检测下限是1×10^1 CFU/mL的菌液和1×10^⁃5 ng/μL的基因组DNA,具有较高的灵敏度。巢式荧光定量PCR法能有效检测出14例临床标本存在洋葱伯克霍尔德菌感染(检出率为40.0%),而Vitek 2 Compact仪器仅检测出10例(检出率为28.6%),其中4例无法识别。结论巢式荧光定量PCR法具有有效、快速和直接应用于临床检测的优点,并且特异、灵敏和准确等特点,值得在临床推广。

基于16S rRNA基因与相关基因序列分析格氏乳球菌亲缘关系

通过PCR扩增7株分离自传统发酵乳制品中的格氏乳球菌的dnaA、rpoB、recA基因,将扩增产物测序,测得的序列构建系统发育树,进行分类鉴定。同时,比较了这三个基因位点与16S rRNA基因揭示的格氏乳球菌种内菌株间以及其与乳酸乳球菌种间的亲缘关系的远近。结果表明,dnaA、rpoB、recA基因能够有效的鉴定出格氏乳球菌,且比16S rRNA基因更清晰地揭示了格氏乳球菌菌株间以及其与乳酸乳球菌种间的亲缘关系,特别是将3个管家基因联合起来,亲缘关系更明确,验证了多个管家基因是研究细菌亲缘关系的有力工具。

死胚中鲍曼不动杆菌的分离鉴定及其致病性和耐药性分析

为了了解山东省某肉种鸡孵化场死胚中鲍曼不动杆菌的感染情况及其致病性和耐药性,试验对6个不同批次种蛋孵化后随机抽检的174枚啄壳未出壳死胚的卵黄液和胎粪利用4种不同培养基进行了细菌的分离,对分离细菌进行了鲍曼不动杆菌碳氢霉烯酶OXA-51基因的测序鉴定。6个批次各取1株鲍曼不动杆菌分离株进行生化试验、小鼠攻毒试验、药敏试验和同源性分析。结果表明:在174枚死胚的卵黄和胎粪中分离得到鲍曼不动杆菌,分离率分别为9.8%和10.9%。检测的6株鲍曼不动杆菌分离株对氨苄西林、氟苯尼考、林可霉素和阿莫西林均100%耐药,所有菌株均表现为多重耐药现象。6株鲍曼不动杆菌分离株对小鼠均表现出较强的致病性。基于recA基因的序列分析表明,鲍曼不动杆菌分离株同源性存在一定差异。说明鲍曼不动杆菌在死胚中分离率较高,并具有高度耐药性和较强致病性。

实时荧光定量PCR法鉴定发酵乳中嗜热链球菌

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,根据目的基因设计特异性引物和探针,建立一种能够快速准确鉴定发酵乳中嗜热链球菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)法,通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对所建立方法进行验证,并使用该方法对市售的60份标识含有嗜热链球菌的发酵乳样品进行检测。结果表明,recA基因具有种间特异性,种间差异率>10%,以其为目的基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测嗜热链球菌;绝对灵敏度达1 pg/μL,相对灵敏度达10^(3) CFU/mL;在培养物水平和基因组水平抗干扰能力良好。采用该方法从60份标识含有嗜热链球菌的发酵乳样品中均能检测出嗜热链球菌,说明实时荧光定量PCR方法能够快速、准确的对发酵乳中嗜热链球菌进行检测。

16S rRNA和recA、groEL基因分类鉴定乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的比较

【目的】比较16S rRNA和recA、groEL基因部分序列用于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种分类鉴定的效果。【方法】对已鉴定的8株分离自传统发酵乳的乳酸乳球菌,选取recA和groEL基因片段,通过PCR扩增、测序,将测序得到的序列比对后构建系统发育树,并与16S rRNA基因序列分析技术进行比较。【结果】比较分析不同菌株16S rRNA和recA、groEL基因的亲缘关系,recA、groEL基因可以准确地完成乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的区分和鉴定。【结论】recA和groEL基因序列分析可以实现乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的区分,因其具有快速、准确、稳定的特点,可适合于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种间的快速分类鉴定。