细粒棘球绦虫AgB8/1-AgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建

目的构建pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm-T/AgB8/1-AgB8/2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确后,转化至E.coliBL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1-AgB8/2重组嵌合蛋白。用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38 kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1-AgB8/2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

5种抗原检测囊型包虫病血清学评价

目的评价细粒棘球蚴纯化囊液粗抗原、天然抗原B(nAgB)及其3个重组亚基检测囊型包虫病的效能。方法从新疆源细粒棘球蚴原头节中提取总RNA,通过RT-PCR获得编码AgB8/1、AgB8/2和AgB8/3基因片段并克隆入pGEX-3X表达载体,IPTG诱导表达分别得到重组蛋白rAgB8/1、rAgB8/2、rAgB8/3;羊细粒棘球蚴囊液经透析沉淀获得纯化囊液粗抗原(HCF)、此纯化囊液粗抗原经煮沸离心弃沉淀得到天然抗原B。用制备的5种抗原分别作为包被抗原,以ELISA法检测囊型包虫病人及其它寄生虫病人和健康人血样中抗体。结果 HCF、nAgB、rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3应用于ELISA法检测囊型包虫病人血清的敏感度依次为90.8%(79/87),87.4%(76/87),67.8%(59/87),78.2%(68/87)和59.8%(52/87);特异度依次为96.0%,96.0%,96.0%,98.0%和97.0%。纯化HCF、nAgB、rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3的诊断效能分别为93.5%,91.9%,82.8%,88.7%和79.6%。纯化HCF和nAgB检测的敏感度高于rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3(P<0.05);rAgB8/2检测的敏感度高于rAgB8/1和rAgB8/3(P<0.05);5种抗原检测的特异度之间均无统计学差异(P>0.05)。结论天然抗原应用ELISA法检测囊型包虫病的效能总体优于重组抗原。