细粒棘球蚴重组EgP-29诱导免疫小鼠脾细胞增殖及细胞因子水平的变化

目的探讨细粒棘球蚴重组抗原(rEgP-29)接种小鼠后的免疫保护机制。方法ICR小鼠随机分为免疫组和对照组,采用rEgP-29免疫、Eg原头蚴攻击感染小鼠后20周,以MTT法检测经刀豆蛋白(ConA)和rEgP-29刺激后T淋巴细胞增殖水平,ELISA法检测体外脾细胞诱生的IL-2、IL-4和IFN-γ水平。结果MTT法检测证实rEgP-29免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖水平明显高于对照组(P<0.05);ELISA法检测表明,免疫组小鼠经ConA或rEgP-29诱生的IL-2、IFN-γ水平与对照组相比显著增加(P<0.05),而IL-4水平无明显变化。结论rEgP-29可能诱导Th1型免疫应答为主,对抗Eg原头蚴攻击感染。

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性研究

目的:探讨细粒棘球蚴(Eg)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值.方法:ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每隔2wk皮下免疫1次,在第3次免疫后2wk,用Eg原头蚴进行攻击感染,感染后20wk剖杀小鼠,检获棘球蚴包囊,计算免疫保护力,并用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平.结果:与佐剂对照组比较,蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为96.6%;与免疫前比较,免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血清IgG,IgG1,IgG2a和IgE水平均明显升高(P<0.05),IgG2b降低(P<0.05).结论:细粒棘球绦虫诊断抗原P-29重组蛋白能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子.

rNDVIL-29对肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨表达IL-29的重组新城疫病毒(recombinant Newcastle disease virus IL-29,r NDV IL-29)对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和细胞凋亡的影响。方法:实验分为r NDV IL-29组(r NDV IL-29感染A549细胞)、NDV组(NDV感染A549细胞)和对照组(PBS)。用Western blotting、RT-PCR、免疫荧光法检测IL-29蛋白及其mRNA的表达;MTT、克隆形成实验及划痕实验检测r NDV IL-29对A549细胞增殖、迁移能力的影响;流式细胞术及Western blotting检测r NDV IL-29对A549细胞凋亡的影响。结果:与NDV组和对照组相比,r NDV IL-29组细胞:(1)IL-29蛋白及其mRNA表达水平显著升高;(2)细胞增殖抑制率明显升高[(56.48±11.89)%vs(42.18±6.18)%,P<0.05],细胞迁移率明显下降[(5.00±4.00)%vs(32.43±3.71)%、(84.57±3.96)%,均P<0.05];(3)Caspase3表达水平明显上调[(29.67±1.53)%vs(18.33±3.06)%、(7.00±6.08)%,均P<0.05],Bcl-2/bax表达水平明显下调[(12.00±2.65)%vs(42.33±5.86)%、(67.00±6.25)%,均P<0.05],细胞凋亡增多。结论:r NDV IL-29抑制肺腺癌A549细胞增殖、迁移,并且促进其凋亡,提示r NDV IL-29可能成为一种很有潜力的抗癌药物。

miRNA29靶基因CCND2和CDK6在宫颈癌中的表达研究

目的研究微小核糖核酸29(miRNA29)靶基因细胞周期素D2重组蛋白(CCND2)及周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)在宫颈鳞癌组织中的表达及其与临床病理各因素之间的关系。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测宫颈鳞状细胞癌组织、子宫颈上皮内瘤变(CIN)组织、正常宫颈组织中CCND2、CDK6的信使核糖核酸(mRNA)水平。结果miRNA29靶基因CCND2在正常宫颈组织、CIN及宫颈鳞状细胞癌组织中的表达有统计学差异(H=29.27,P=0.00)。miRNA29靶基因CDK6在宫颈鳞状细胞癌组织、CIN及正常宫颈组织中表达水平无统计学差异(H=2.76,P=0.25)。在CIN组织中,CCND2与CDK6存在正相关(r=0.58,P<0.05)。结论 miRNA29靶基因CCND2可能参与宫颈癌的发生发展;CDK6与宫颈癌发生发展缺乏相关性;CCND2和CDK6在CIN发生发展中可能起协同作用。

pcDNA3.1/DLC-1重组质粒的构建及其在HT-29细胞中的表达

目的构建和表达DLC-1(deleted in liver cancer)基因重组质粒。方法用PCR法得到DLC-1基因片段,此基因片段带有XbaⅠ和BamHⅠ两个酶切位点,然后将此片段和真核表达载体pcDNA3.1连接,转化大肠杆菌DH5a,利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质粒转染到结肠癌HT-29细胞中,再用RT-PCR法检测重组质粒的表达。结果重组质粒经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切和测序与DLC-1基因序列一致;利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质粒导入HT-29细胞,获得了DLC-1基因的表达。结论成功构建pcDNA3.1/DLC-1重组质粒并在HT-29细胞内表达。

重组新城疫病毒IL29抑制人胃癌细胞系BGC的增殖与迁移

目的探讨表达IL-29的重组新城疫病毒Lo Sota株(rL-IL29)对人胃癌BGC细胞增殖及迁移的影响及其机制。方法将体外培养的人胃癌BGC细胞分为对照组、rL-IL29组和Lo Sota株新城疫病毒(NDV)组,分别经PBS、rL-IL29及NDV感染处理后进行下一步实验。蛋白质印迹检测BGC细胞中IL-29、NDV、P-ERK、MMP2、p-AKT蛋白的表达;CCK8法、划痕试验及Transwell小室法侵袭实验检测胃癌BGC细胞的增殖、迁移能力。结果IL-29蛋白仅在rL-IL29组表达,NDV蛋白在IL-29组及NDV组均稳定表达,且明显高于PBS组(P<0.05);rL-IL29感染BGC细胞后BGC细胞的增殖及迁移能力明显减弱,且rL-IL29的抑制较NDV组作用更强;BGC细胞经rL-IL29感染后P-ERK、MMP2(66 ku/72 ku)、p-AKT蛋白表达较对照组及NDV组明显减弱(P<0.05)。结论rL-IL29抑制胃癌BGC细胞的增殖、侵袭及迁移可能与ERK,AKT等信号通路相关。

人IL-29定点突变体抗肿瘤细胞增殖活性分析

为分析人白细胞介素-29(h IL-29)变异体抗肿瘤细胞增殖活性,采用大引物PCR方法对人h IL-29基因第104位碱基进行点突变,使h IL-29肽链第35位Arg定点改造为Lys。得到的h IL-29变异体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达,经纯化获得重组蛋白rh IL-29mut35。SDS-PAGE分析显示rh IL-29mut35的相对分子质量约23×103,Western Blotting鉴定显示其与羊抗人IL-29多克隆抗体发生特异性结合反应。用CCK-8试剂检测rh IL-29mut35对肿瘤细胞增殖的影响,rh IL-29mut35在不同质量浓度时对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8的增殖均有抑制作用,高剂量组(1 000 ng/m L)rh IL-29mut35对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8增值的抑制率分别为(34.20±1.50)%、(27.30±0.31)%、(30.20±0.68)%、(29.13±1.40)%,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。而且高剂量组的抗增殖效应高于野生型rh IL-29的(P<0.01),这为进一步研制开发IL-29的抗肿瘤药物奠定基础。

Expressions of miRNA29 target genes CCND2 and CDK6 in cervical cancer

Objective: To study the expression of miRNA29 target genes recombinant cyclin D2 (CCND2) and cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) in cervical squamous cell carcinoma tissues and their relationship with clinicopathological factors. Methods: Levels of mRNA of CCND2 and CDK6 in cervical squamous cell carcinoma tissues, cervical intraepithelial neoplasia (CIN) tissues and normal cervical tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: There was a statistical difference in the expression of CCND2 (one of miRNA29 target genes) in normal cervical tissues, CIN tissues and cervical squamous cell carcinoma tissues (H = 29.27, p = .00), but there was no statistical difference in the expression of CDK6 (one of miRNA29 target genes) in them (H = 2.76, p = .25). CCND2 was positively correlated to CDK6 in CIN tissues (r = 0.58, p < .05). Conclusions: CCND2, one of miRNA29 target genes, may be involved in the occurrence and development of cervical cancer, but CDK6 is less relevant to the occurrence and development of cervical cancer;CCND2 and CDK6 may play a synergistic role in the occurrence and development of CIN.

海上平台发电机故障原因分析及防范

介绍某海上平台柴油发电机组出现非正常关停,从发电机控制原理对其进行故障分析,最终将故障排除,并总结此类故障的防范措施。

重组人白介素-29-Fc融合蛋白在HEK-293F细胞中的表达及体外抗肿瘤活性分析

目的在人胚肾293F(human embryonic kidney 293F,HEK-293F)细胞中表达重组人白介素-29-Fc(recombinant human interleukin-29-Fc,rhIL-29-Fc)融合蛋白,并分析其体外抗肿瘤活性。方法构建重组UCOE-IL-29-Fc表达质粒,瞬时转染HEK-293F细胞,经表达、纯化后获得rhIL-29-Fc融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定;将rhIL-29和rhIL-29-Fc蛋白分别经左耳皮下免疫雌性日本大耳白兔,每组2只,0.5 mg/只,右耳静脉采血,分离血清,ELISA法检测半衰期;CCK-8试验检测rhIL-29-Fc蛋白对人结肠癌HT-29、人结肠癌HCT-116、人Burkkit淋巴瘤Daudi、人非小细胞肺癌NCI-H1975、人小细胞肺癌NCI-H209、人食管癌EC109和人胰腺癌PANC-1细胞的体外抗增殖效果,并计算半数抑制浓度(inhibitory concentration 50,IC_(50))。结果重组表达质粒UCOE-IL-29-Fc经双酶切及测序鉴定证明构建正确,瞬时转染HEK-293细胞6 d后,收获培养上清,经纯化获得的rhIL-29-Fc融合蛋白相对分子质量与预期相符,蛋白浓度为1.5 mg/mL,纯度为93%,可与小鼠抗人IL-29抗体特异性结合。rhIL-29-Fc蛋白半衰期为25 h,对7种肿瘤细胞显示出不同程度的增殖抑制效应,对不同细胞的IC50也不同。结论利用HEK-293F细胞成功表达rhIL-29-Fc融合蛋白,该融合蛋白半衰期比rhIL-29延长了20 h。根据7种肿瘤细胞显示出不同程度的体外增殖抑制效应和IC50测定结果,发现rhIL-29-Fc融合蛋白的抗肿瘤活性高于rhIL-29。该研究为IL-29蛋白治疗肿瘤的开发奠定了基础。

miR-29b2c重组腺病毒的构建及对胃癌细胞增殖和迁移的影响

构建了miR-29b2c重组腺病毒Ad-miR-29b2c,考察了其对HGC-27、MGC-803胃癌细胞增殖及迁移的抑制作用。采用PCR从基因组扩增miR-29b2c片段,并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-29b2c,经酶切及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架载体共转化BJ5183感受态,产生重组腺病毒质粒Ad-miR-29b2c,再经PacⅠ线性化后转染293A细胞进行包装。重组腺病毒扩增后感染HGC-27细胞,通过MTT及细胞迁移实验观察Ad-miR-29b2c对HGC-27、MGC-803细胞增殖及迁移的影响。采用Western blotting检测Ad-miR-29b2c对HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达的影响。酶切、测序及荧光定量PCR结果表明重组腺病毒构建成功,miR-29b及miR-29c在HGC-27细胞过表达。MTT实验表明Ad-miR-29b2c能显著抑制HGC-27、MGC-803细胞增殖。细胞迁移实验表明Ad-miR-29b2c能显著抑制HGC-27、MGC-803细胞迁移。此外,Ad-miR-29b2c能显著降低HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达水平。综上所述,构建了miR-29b2c的重组腺病毒,并发现其可以抑制胃癌细胞HGC-27和MGC-803的增殖及迁移,该作用可能与miR-29抑制HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达有关。

人IL-29第43位Lys的定点突变及抗肿瘤活性初步分析

为获得人白介素-29(h IL-29)变异体并考察其对肿瘤细胞增殖的影响,基于对h IL-29成熟肽生物信息学的分析结果,通过大引物PCR方法将其肽链第43位赖氨酸(Lys)编码基因进行定点突变。将得到的h IL-29变异体基因插入质粒p PIC9KM,构建重组真核表达质粒p PIC9KM-h IL-29^(mut43),导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,经G418筛选得到高产菌株p PIC9KM-h IL-29^(mut43)/GS115,用甲醇诱导表达重组蛋白rh IL-29^(mut43)。检测rh IL-29^(mut43)对肿瘤细胞增殖的影响,结果显示该重组蛋白对结肠癌细胞HCT8、肺腺癌细胞A549、胃癌细胞SGC7901和肝癌细胞BEL7402的增殖均有抑制作用,且高浓度(1 000 ng/ml)下对上述4种肿瘤细胞的增殖抑制作用更强,增殖抑制率分别为(18.45±0.83)%、(27.14±2.99)%、(29.94±1.95)%和(25.22±0.42)%。与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。且其抑制增殖效应强于野生型h IL-29和阳性对照药人干扰素(IFN)-a2b。

马来丝虫肌球蛋白29表位基因真核表达质粒及原核表达蛋白免疫小鼠诱导的免疫应答

目的观察马来丝虫肌球蛋白29(Brugia malayi myosin 29,Bm M29)表位基因真核表达质粒pc DNA3.1(+)-Bm M29和原核表达的纯化重组蛋白r Bm M29免疫小鼠诱导的免疫应答效果。方法在大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21诱导表达重组蛋白r Bm M29,纯化后作为重组蛋白疫苗;纯化真核表达重组质粒pc DNA3.1(+)-Bm M29作为核酸疫苗。核酸疫苗免疫注射部位为小鼠后腿胫前肌,重组蛋白为皮下多点注射。60只BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D、E组,每组12只,分别注射PBS(100μg)、pc DNA3.1(+)/Cp G(100μg/30μg)、pc DNA3.1(+)-Bm M29/Cp G(100μg/30μg)、r Bm M29/Cp G(50μg/30μg)、pc DNA3.1(+)-Bm M29/r Bm M29/Cp G(前2次注射pc DNA3.1(+)-Bm M29/Cp G 100μg/30μg,第3次注射r Bm M29/Cp G 50μg/30μg),共免疫3次,每次免疫间隔2周。初次免疫后第4、6、8周,眼球摘除法采血制备血清,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性Ig G抗体效价。免疫第8周处死小鼠,制备脾细胞悬液培养48 h,ELISA检测培养上清中细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)水平。结果 ELISA检测结果显示,A、B、C、D和E组小鼠初次免疫后第4周血清中抗体的吸光度(A490值)分别为0.038±0.050、0.053±0.009、0.360±0.035、0.456±0.025、0.370±0.025,第6周分别为0.045±0.003、0.045±0.005、0.510±0.018、0.548±0.010、0.552±0.018,第8周分别为0.041±0.004、0.044±0.009、0.606±0.047、0.674±0.042、0.770±0.041,C、D、E组均高于A、B组(P<0.05),第8周时,E组Ig G抗体的A490值高于C组和D组(P<0.05)。初次免疫后第8周,A至E组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的水平分别为(47.72±8.94)、(50.43±2.81)、(304.78±8.42)、(242.28±5.99)、(426.52±6.76)pg/ml,C、D、E组均高于A、B组(P<0.05),E组高于C组和D组(P<0.05);小鼠脾细胞培养上清中IL-4的水平分别为(60.00±11.14)、(57.71±15.95)、(93.17±12.56)、(96.67±11.48)、(101.17±5.81)pg/ml,C、D、E组均高于A、B组(P<0.05)。结论 pc DNA3.1(+)-Bm M29核酸疫苗和r Bm M29重组蛋白均可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,核酸疫苗与重组蛋白疫苗联合免疫效果更佳。