应用GPV VP3基因重组原核表达产物建立检测抗体的ELISA方法研究

利用鹅细小病毒（GPV）VP3基因的原核表达蛋白作为包被抗原建立了检测GPV抗体的间接ELISA及Dot-ELISA方法。经确定两种方法的抗原包被浓度为125μg／mL，其中间接-ELISA 100μL／孔、Dot-ELISA 5μL／点。间接-ELISA中HRP标记的兔抗鹅IgG的工作浓度是1：200，检测血清的最适稀释度是1：400，阳性判定标准为OD492≥0．20，且P／N≥2．0。用此方法检测弱毒疫苗免疫血清，其抗体滴度在1：400～1：51200。Dot-ELISA的结果与间接-ELISA的结果一致。

鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达

参照鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)的基因组序列设计了1对VP3基因特异性扩增引物,通过RT-PCR方法扩增获得了DHAV-1a结构蛋白VP3基因,将纯化的VP3基因与pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector连接,构建DHAV-1aVP3基因克隆重组质粒,然后将VP3基因片段插入pET-32a(+)表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以1.0mmol·L-1 IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP3基因于大肠杆菌中成功表达,其分子量为47kDa,且表达的VP3蛋白能够与Anti-His Mouse mAb发生特异性反应,具有良好的生物活性,为进一步研究DHAV-1aVP3蛋白功能和以VP3蛋白为抗原研制DHAV-1a诊断试剂盒奠定基础。

重组小鼠14-3-3蛋白theta亚型的构建

目的克隆编码14—3—3蛋白质θ亚型的cDNA，制备该蛋白质的基因重组蛋白质．方法参照小鼠14—3-3蛋白质θ亚型mRNA结构设计引物，以小鼠脑总RNA为模板，RT—PCR法克隆编码14—3—3蛋白质θ亚型的cDNA，插入原核表达质粒pGEX-4T-1，转化大肠杆菌BL21（DE3）使其表达谷胱甘肽S转移酶（GST）为标签的融合蛋白质，以凝血酶定点分解融合蛋白并采用GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化目的蛋白．结果RT—PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离可见约800bp条带，序列分析表明重组质粒pGEX-1433theta中的插入子为738bp，编码245个氨基酸，其核苷酸及氨基酸序列与PubmedNM-011739展示的结果一致．重组质粒pGEX-1433theta在BL21（DE3）中的表达量随IPTG诱导时间递增，融合蛋白质为可溶性组分．亲和层析纯化的14—3—3theta在SDS．PAGE上表现为单一条带，表观相对分子质量为30ku．每L培养菌液可收获4mg基因重组型小鼠14—3—3theta．结论克隆了编码小鼠14—3-3蛋白质θ亚型的cDNA，制备了高纯度基因重组型小鼠14—3—3theta，为进行单克隆抗体的制备奠定了坚实的基础．

新型鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

应用PCR方法扩增了新型鸭细小病毒(novel duck parvovirus,NDPV)的VP3基因,然后将其克隆到原核表达载体p GEX-4T-1中,获得重组质粒p GEX-VP3。将p GEX-VP3转化BL21感受态细胞后,用1.0mmol/L IPTG于37℃进行诱导。最后,分别用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定。结果,NDPV VP3蛋白在大肠杆菌细胞中成功获得表达,表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量为84 ku。将纯化的重组VP3蛋白免疫实验家兔,制备多克隆抗体。Western-blot检测结果表明,该抗体能同时与重组的NDPV VP3蛋白及自然感染的NDPV发生反应,说明制备的抗体具有良好的抗原反应性。这些结果为进一步建立NDPV检测方法和研发新型疫苗研究奠定了物质基础。

TRAIL_(114～281)-IL-24融合蛋白的原核表达及其体外抗肿瘤细胞活性

目的原核表达肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)114～281肽和人白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)融合蛋白,并检测其体外抗肿瘤细胞活性。方法以人外周血单个核细胞总RNA为模板,PCR扩增TRAIL114～281和IL-24基因,经T4DNA连接酶连接成融合基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a/TRAIL114～281-IL-24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白TI经层析法纯化后,进行Western blot分析,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,caspase3活性检测试剂盒检测其对不同肿瘤细胞caspase3活性的影响。结果重组表达质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;TI融合蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度可达95%,且可与鼠抗人IL-24抗体发生特异性反应;经复性的蛋白能明显抑制人宫颈癌上皮细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并显著提高肿瘤细胞的caspase3活性。结论已在大肠杆菌中表达了TRAIL114～281-IL-24融合蛋白,其具有诱导部分肿瘤细胞凋亡的活性。