重组杀菌渗透性增加蛋白21在大鼠内毒素血症中保护机制的研究

目的探讨重组杀菌渗透性增加蛋白21(rBPI21)在大鼠内毒素血症中保护效应的机制。方法给内毒素血症大鼠注射不同剂量的rBPI21,动态观察rBPI21不同剂量组大鼠血液中内毒素(LPS)、脂多糖结合蛋白(LBP)、肿瘤坏死因子α(TNFα)含量的变化。结果rBPI21治疗1组(rBPI21剂量为0.625 mg/kg)大鼠,6、12 h血浆LPS含量明显低于内毒素组大鼠相同时间点LPS含量(P<0.01),血清LBP、TNFα含量各检测时间点均明显低于内毒素组大鼠相同时间点的含量(P<0.01);与内毒素组大鼠相比,rBPI21治疗2、3、4组(rBPI21剂量分别为1.25、2.5、5.0 mg/kg)大鼠各检测时间点血浆LPS,血清LBP、TNFα含量均明显降低,大鼠24 h生存率由内毒素组的16.7%分别上升到58.3%、91.7%、100.0%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论rBPI21对内毒素血症大鼠的保护作用机制主要是通过促进体内LPS的聚合和清除,降低LPS活性,从而抑制LBP的生成,减少TNFα等细胞因子的过度表达。

重组杀菌渗透性增加蛋白21在大鼠内毒素血症中保护机制的探讨

目的探讨重组杀菌渗透性增加蛋白21(rBPI21)在大鼠内毒素血症中保护效应的机制。方法给内毒素血症大鼠注射不同剂量的rBPI21,动态观察rBPI21不同剂量组大鼠血液中内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量的变化。结果rBPI21治疗1组(rBPI21剂量为0.625mg/kg)大鼠,6,12h血浆LPS含量明显低于内毒素组大鼠相同时间点LPS含量(P<0.01),血清TNF-α含量各检测时间点均明显低于内毒素组大鼠相同时间点的含量(P<0.01)。与内毒素组大鼠相比,rBPI21治疗2、3、4组(rBPI21剂量分别为1.25,2.5,5.0mg/kg)大鼠各检测时间点血浆LPS、血清TNF-α含量均明显降低(P<0.01)。结论rBPI21对内毒素血症大鼠的保护作用机制主要是通过促进体内LPS的聚合和清除,降低LPS活性,减少TNF-α等细胞因子的过度表达。

BPI_(m23)重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的 :采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm2 3抗菌蛋白。方法 :利用构建的pUC1 8 synBPI4 1 4质粒和PBV2 2 0 BPIm4 2 0 质粒 ,按分子克隆方法构建pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;用线性化pPICZα synBPIm6 0 0 质粒电转化PichiapastorisGS1 1 5 ,筛选抗性转化子 ,进行PCR和Mut表型鉴定 ;用甲醇诱导目的蛋白rBPIm2 3的表达 ;用离子交换层析纯化rBPIm2 3,并进行SDS PAGE分析、Westernblot鉴定和用BCA法定量。结果 :①成功构建了pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;②获得稳定整合目的基因的GS1 1 5菌株 ;③表达产物相对分子量约为 2 3kD ,可与抗BPI抗体特异性结合 ;④培养上清液中目的蛋白表达量约为 2 9mg L。结论 :BPIm2 3重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS1 1 5中得到分泌表达。

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。

rBPI_(23)基因克隆与鉴定

目的 :rBPI2 3基因 (BPI60 0bp)克隆与鉴定。方法 :采用RT PCR技术 ,从HL 6 0细胞mRNA中扩增编码BPIN端 199个氨基酸 (rBPI2 3)的基因片段 (BPI60 0bp) ,经酶切后通过连接反应构建重组克隆载体 ,测序鉴定。结果 :RT PCR获得预期的扩增产物—BPI60 0bp基因片段。成功构建PUC18 BPI180 、PUC18 BPI4 2 0 重组克隆载体 ,酶切、酶谱分析与预期结果相符。DNA测序结果与文献报道一致。结论 :PUC18 BPI180 、PUC18 BPI4 2 0 重组克隆载体构建成功 ;BPI60

重组杀菌/通透性增加蛋白对内毒素休克中肝脏一氧化氮合酶的影响

目的：探讨重组杀菌／通透性增加蛋白（ｒＢＰＩ_(２１)）对内毒素休克中肝组织一氧化氮合酶（ＮＯＳ）的影响及其意义。方 法：大鼠腹腔注射大肠杆菌内毒素（１５．０ｍｇ／ｋｇ）复制内毒素休克模型，动物随机分成正常对照组、内毒素休克组和 ｒＢＰＩ_(２１)治疗组。检测肝组织ＮＯＳ活性、三磷酸鸟苷环水解酶１（ＧＴＰ－ＣＨＩ）活性及生物喋呤含量，同时还观察肝脏微循环 血流灌注量的改变。结果：内毒素攻击后肝组织诱生型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）活性急剧升高（Ｐ＜０．０１），但原生型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）活 性变化不明显（Ｐ＞０．０５）。 ｒＢＰＩ_(２１)治疗可显著抑制ｉＮＯＳ活性，明显提高肝脏微循环灌注量（Ｐ＜０.０１）；同时局部组织的 ＧＴＰ－ＣＨＩ活性降低（Ｐ＜０．０１），生物喋呤含量也显著Ｆ降（Ｐ＜０.０５）。结论：内毒素休克早期给予ｒＢＰＩ_(２１)能选择性抑制肝 组织ｉＮＯＳ活性并改善局部微循环，其作用机理可能与降低组织ＧＴＰ－ＣＨＩ活性及其介导生物喋呤诱生有关。

小鼠Bpi条件基因打靶载体的构建和鉴定

目的构建小鼠Bpi条件基因打靶载体,为建立Bpi条件基因打靶小鼠模型和深入研究Bpi基因功能奠定基础。方法采用Cre/LoxP系统,选择小鼠Bpi基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入LoxP位点;运用LA-PCR技术,以129品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括Bpi第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1 kb基因片段以及下游同源臂4.9 kb基因片段;构建pBSKⅡ-5SLoxP和ploxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1 kb)与酶切后的ploxPFRTNeo-3L质粒相连获得Bpi条件基因打靶载体。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的pBSKⅡ-5SLoxP、ploxPFRTNeo-3L重组质粒和Bpi条件基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Bpi条件基因打靶载体。