中和低剂量重组人凝血因子Ⅷ防治血友病A关节出血的疗效

目的 比较中、低剂量重组人凝血因子Ⅷ防治血友病A关节出血的临床疗效.方法将58 例血友病A患儿按预防剂量的大小分为2组：中剂量组（28例）和低剂量组（30例）.中剂量组采用重组人凝血因子Ⅷ15～25 ·kg-1静脉推注,3次周-1,连用4个月;低剂量组采用重组人凝血因子Ⅷ＜15 U·kg-1静脉推注,3次＆#183;周-1,连用4个月.观察2组防治前、防治4个月后关节出血次数的情况.结果 2组防治4个月后关节出血次数明显低于防治前（P＜0.05）,中剂量组防治4个月后关节出血次数明显低于低剂量组（P＜0.05）.结论 重组人凝血因子Ⅷ用于防治血友病A能明显改善关节出血症状,且中剂量防治优于低剂量.

精子载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达

利用精子载体技术通过人工授精观察人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达。将含有人FⅧBD(B-domain deleted)cDNA的质粒pRC/RSV-hFⅧBD转染至小鼠精子,通过人工授精使母鼠受孕。新生小鼠出生后第4周,应用PCR筛查hFⅧBD cDNA阳性转基因幼鼠,取转有人FⅧBD cDNA幼鼠的血液检测血浆中的人FⅧ抗原和抗体,分别用Northern印迹和Western印迹检测脾、肝、肺和肾组织中人FⅧBD cDNA的转录和表达。结果发现,人工授精后20只受体母鼠7只受孕,共产下11只仔鼠,存活9只。PCR筛检出3只转有人FⅧBD cDNA的阳性鼠。3只阳性鼠血浆中的人FⅧ抗原量分别为8.65 ng/ml,7.84 ng/ml和8.44 ng/ml,人FⅧ的抗体均为阴性。Northern印迹和Western印迹检测显示3只F1代阳性幼鼠的脾、肝、肺和肾组织中均有人FⅧBD cDNA的转录和表达。结论提示,利用精子载体法可以制备转有人凝血因子Ⅷ基因的转基因小鼠,并表达人FⅧ蛋白,这为用精子载体技术生产转基因动物并将之作为生物反应器生产人凝血因子Ⅷ提供了实验依据。

重组人凝血因子Ⅷ在中国血友病A患者的有效性及抑制物产生的观察

目的探讨重组人凝血因子Ⅷ(Kogenate FS,拜科奇)在中国血友病A患者的有效性、安全性及抑制物产生率。方法采用拜科奇治疗30例血友病A患者的出血事件,观察其临床止血效果及用药后4周FⅧ抑制物的产生情况。其中11例患者在用药前后进行血、尿便常规、肝肾功、血清病毒学(HBV、HCV、HIV)、FⅧ抑制物、FⅧ活性检测,并于第1次用药后10min、60min检测FⅧ活性;同时随访2年检测FⅧ抑制物。结果11例患者在用药后10min、60min较用药前FⅧ活性明显提高,达到或接近预期升高值;所有30例患者用药后出血症状停止,显效率达100。每次出血事件约86.7的患者在≤3次输注即可较好的控制症状,提示具有较好的有效性。30例患者共输注重组FⅧ70次,总计51294u,在用药期间无任何不良反应出现。本研究发现1例患者在用药后4周产生FⅧ抑制物,提示短期抑制物产生率为3.3(1/30),11例2年随访未见抑制物产生增加趋势。结论重组人凝血因子Ⅷ(Kogenate FS,拜科奇)在中国血友病A患者使用中具有较好的有效性、安全性及较低的抑制物产生率。

基因重组人凝血因子Ⅷ在中国人血友病A患者中使用的研究

目的探讨第二代rFⅧ(Kogenate FS)在中国人血友病A患者中使用的安全性和有效性。方法采用第二代rFⅧ(Kogenate FS)治疗14例血友病A志愿者患者,用药前进行FⅧ抗体、FⅧ:C活性、血清病毒学(HBV、HCV和HIV)、血常规、尿常规、大便常规以及肝肾功能检查,于第一次用药后10 min和60 min进行FⅧ:C测定,治疗结束后进行FⅧ抗体和肝肾功能检测。结果①采用Kogenate FS治疗的14例血友病A志愿者患者中,Kogenate FS用量12．99～25．00 u／kg(平均18．74 u／kg),总用量3 000～11 000 u(平均6 570 u),自治疗至出血停止或出血症状改善所需的时间为1．5～5．5 d(平均3．29 d),除1例FⅧ抗体滴度较高者外,其余13例患者第一次用药后10 min和60 min FⅧ: C活性均明显升高,用药前后FⅧ:C活性比较差异具有显著性(P<0．01)。显效13例(占92．86％),好转1例(占7．14％),总有效率为100％。②14例血友病A志愿者患者中,用药前FⅧ抗体阳性2例,其中1例FⅧ抗体>5 Bu,第一次用药后10 min和60 min FⅧ:C活性无明显升高,治疗结束后FⅧ抗体仍然>5 Bu,但出血症状改善;另1例FⅧ抗体为4 Bu,第一次用药后10 min和60 min FⅧ:C活性显著升高,治疗结束后FⅧ抗体转为阴性。③14例血友病A志愿者患者在应用Kogenate FS治疗期间和治疗结束后均表现出良好的耐受性,无不良事件或药物不良反应发生。结论第二代rFⅧ(Kogenate FS)治疗中国人血友病A患者耐受性好,安全有效。

长期小剂量凝血因子Ⅷ预防重度血友病A患儿关节出血的疗效与相关因素分析

目的探讨重组人凝血因子Ⅷ(FⅧ)长期小剂量次级预防重度血友病A患儿关节出血的疗效与相关因素。方法对2010年4月1日～2011年4月1日我院16位2～16岁重度血友病A患儿进行FⅧ预防性静脉输注(每次5～15 U/kg,间隔3 d),记录治疗前1年与治疗后1年的关节出血次数,同一关节反复出血的情况,治疗前后FⅧ抑制物产生情况,梅毒、艾滋病、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝感染情况及肝功能变化。结果治疗前1年关节出血次数为(29.69±4.48),治疗后1年关节出血次数为(10.94±3.30)次,治疗前后比较差异有显著性(P<0.01)。治疗前靶关节出血发生率为45.2%,治疗后靶关节出血发生率为14.6%,治疗前后比较差异有显著性(P<0.01)。治疗后FⅧ抑制物产生率为12.5%,产生率低及抗体滴度低,治疗前后梅毒、艾滋病、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝均阴性,肝功能正常。结论 FⅧ长期小剂量次级预防输注可有效减少中重度血友病A患儿关节出血次数,同时可有效减少靶关节出血发生率,从而在一定程度上保护关节的功能,且FⅧ抑制物产生率及滴度低,无相关疾病传播,安全可靠。

注射用重组人凝血因子Ⅷ治疗血友病A的护理

目的探讨注射用重组人凝血因子Ⅷ(拜科奇)治疗血友病A的护理方法和要点。方法通过对7例血友病A患者31次使用注射用重组人凝血因子Ⅷ进行治疗时,予心理护理、药物配制、用药观察以及健康教育等护理干预。结果 7例血友病A患者31次使用注射用重组人凝血因子Ⅷ治疗,均未见不良反应。结论在使用注射用重组人凝血因子Ⅷ治疗中,加强药物及患者的护理,可减少不良反应,提高患者的治疗依从性与治疗效果。

血友病A FⅧ基因内含子22重组基因型及检测方法

FⅧ基因内含子22重复序列发生染色体内相反方向的同源重组引起内含子22倒位,导致约45%-50%的重型血友病A;而同一染色体内、同源染色体间或染色单体之间的相同方向内含子22重复序列(intron 22homologous region,int22h)的重组导致两序列中间区域的复制或缺失,可以引起内含子22倒位的检测出现假阳性或假阴性。改良的长距离PCR及反向转变PCR(inverse shifting PCR,IS-PCR)可用于区分上述所有可能的int22h重组基因型。

凝血因子Ⅷ制备工艺研究

凝血因子ⅤⅢ制剂是治疗血友病甲的最主要血液制品。８０年代中期发展了新一代血浆凝血因子ⅤⅢ浓制剂及基因重组凝血因子ⅤⅢ技术，不仅提高了凝血因子ⅤⅢ制剂的纯度，减少了副作用，而且降低了病毒感染的危险性。本文介绍凝血因子ⅤⅢ制剂的生产及病毒灭活工艺。

凝血因子Ⅷ C2结构域表达载体的构建及其在真核细胞NIH3T3中的表达

目的 :构建人凝血因子 F 中具有免疫活性的 C2结构域表达载体并通过真核宿主细胞表达出多肽。方法 :从 HEK2 93细胞提取总 RNA,经 RT- PCR扩增获得目的片段。将该片段与信号肽共同构建在同一表达载体 ,并在 NIH 3T3细胞中表达 ,Western blotting检测。结果 :经限制性酶切鉴定和测序分析证实 ,采用 RT- PCR成功地完成 F - C2 c DNA的扩增和表达载体的构建 ,重组载体转染进入 NIH 3T3细胞后 ,经检测培养上清中的蛋白成分证实 ,成功地表达出 F - C2结构域多肽。结论 :重组表达载体的构建是表达出分泌型 F C2多肽的一种可行的方法。

B结构域糖基化位点对凝血因子Ⅷ分泌和活性的影响

目的:研究B结构域糖基化位点对凝血因子Ⅷ分泌和活性的影响。方法:通过反向PCR技术在凝血因子ⅧA2和A3结构域之间插入B结构域的糖基化序列,PCR后进行重组连接、质粒转化、克隆筛选、质粒抽提等步骤,构建重组人凝血因子Ⅷ载体,然后再通过活性检测试剂盒检测胞外分泌因子Ⅷ活性,用ELISA(双抗体夹心法)检测胞外分泌因子Ⅷ总表达,用Western印迹检测重组因子Ⅷ在胞内的总表达。结果:B结构域糖基化点的增加使得因子Ⅷ的胞外相对活性最高提高了1倍。结论:糖基化位点的加入可以增强因子Ⅷ的胞外活性,如果适当增加糖基化位点的长度和数量(单个糖基化位点重复出现或多个糖基化位点连接),可以进一步提高因子Ⅷ的胞外表达和活性。

新鲜冰冻血浆融化后凝血因子Ⅷ含量动态分析

目的探讨存放时间和存放温度对新鲜冰冻血浆(FFP)融化后凝血因子Ⅷ含量的影响。方法将24份血型为B型的新鲜冰冻血浆在37℃水浴箱中融化后,每袋均分成A、B袋,A袋存放在室温环境(25℃)中,B袋存放于4℃冷藏箱内,在0、15、30、45 min,1、3、4、24 h每袋各取样1次5 m L,立即用CA-1500血凝仪采用凝固法进行凝血因子Ⅷ定量检测。结果 FFP融化后凝血因子Ⅷ含量随存放时间延长而降低;同一时间点,4℃冷藏箱内存放的FFP其凝血因子Ⅷ含量衰变速度低于室温条件,且自45 min开始2袋衰变速度比较(P<0.05);同条件下凝血因子Ⅷ检测结果:1)室温中从30、45、60、180、240 min,24 h分别与0 min(即融化时)比较(P<0.05);2)4℃冷藏箱内,从1、3、4、24 h分别与0min比较(P<0.05);4 h室温保存下FFP所含凝血因子Ⅷ含量下降60%,4℃冷藏箱内FFP所含凝血因子Ⅷ含量下降40%。结论保存温度和保存时间直接影响新鲜冰冻血浆(FFP)融化后凝血因子Ⅷ含量,为保证凝血因子Ⅷ输注效果,临床上应在FFP融化后尽快输注。同样凝血因子Ⅷ含量监测试验中应尽可能在FFP融化后立即测试,融化后超过30 min测试,结果将出现显著性偏差。

蛋白C、蛋白S、FⅫ、FⅧ与静脉血栓栓塞的相关性研究

目的探讨蛋白C、蛋白S、凝血因子Ⅻ、凝血因子Ⅷ与静脉血栓栓塞的关系。方法以2012年8月至2014年9月我院收治的静脉血栓栓塞患者为实验组(66例),以同时期在我院体检的健康成人为对照组(66例),运用法国STA-R全自动凝血仪检测实验组和对照组血浆中的蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ的活性,采用利用t检验和χ2检验分析相关数据。结果与对照组相比,实验组中蛋白C和蛋白S的活性明显降低(P<0.05),而FⅫ和FⅧ的活性明显增高(P<0.05);实验组中FⅧ出现活性异常的比率为59.09%(39例),实验组中蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ活性出现异常的比率明显比对照组高(P<0.05)。结论蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ与静脉血栓栓塞关系密切,是静脉血栓栓塞形成的高危因素。

重组人凝血因子Ⅷ细菌内毒素检测方法研究

为建立重组人凝血因子Ⅷ细菌内毒素检查方法,按《中国药典》2015年版(二部)附录收载的细菌内毒素检查方法及指导原则开展试验。结果表明,鲎试剂动态浊度法在适当的稀释倍数下,重组人凝血因子Ⅷ细菌内毒素检测方法准确可靠,可以用于对重组人凝血因子Ⅷ原液、半成品、成品的检定,且不受人员、仪器和日期的影响。

中剂量重组人凝血因子Ⅷ防治血友病A效果观察

目的观察中剂量重组人凝血因子Ⅷ对血友病A患儿关节损害及生活质量的影响。方法选取在医院门诊就诊的重型血友病A患儿36例,随机分为试验组和对照组各18例,试验组采用中等剂量重组人凝血因子Ⅷ预防治疗(FⅧ 15～30 U/kg,每周3次),对照组采用低剂量预防治疗(每次10 U/kg,每周2次),比较2组患儿入组前和1年后最严重单个靶关节评分差值及SF-36生活质量评分差值。结果试验组关节评分差值及SF-36生活质量评分差值均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论中剂量重组人凝血因子Ⅷ对重型血友病患儿关节损害及生活质量评分改善优于低剂量,对重型血友病患儿提倡中剂量预防方案。

唑来膦酸细菌内毒素质量控制及rFC方法学研究

目的:统一唑来膦酸注射液细菌内毒素检测标准,并建立重组C因子(rFC)检测方法。方法:用凝胶法(BET)对13批次国家监督抽验唑来膦酸注射液进行检测;用2个厂家rFC试剂盒,对3个厂家不同浓度(500、100、50、25μg·mL-1)的唑来膦酸注射液测进行干扰试验。结果:规格100 mL:5 mg的,按1 mL<0.50 EU进行检测,其他规格的按1 mg<5.0 EU进行检测,结果均符合规定。25μg·mL^(-1)两个厂家rFC试剂盒回收率均在50%~200%之间。rFc法验证:对8批次唑来膦酸注射液,按25μg·mL^(-1)进行验证,对5批次唑来膦酸注射(100 mL:5 mg),按0.5 EU·mL^(-1)进行验证,回收率均在50%~200%之间。结论:唑来膦酸注射液的细菌内毒素检查法可拟定为:取本品,依法检查(通则1143),每1 mL中含内毒素的量应小于0.50 EU(100 mL及以上规格大输液);取本品,依法检查(通则1143),每1 mg唑来膦酸中含内毒素的量应小于10.0 EU。细菌内毒素重组C因子试剂盒检测方法:取本品,用细菌内毒素检查用水稀释为每1 mL含唑来膦酸25μg、或1倍稀释(规格100 mL:5.0 mg大输液),按试剂盒的说明书进行检测,回收率应在50%~200%之间。

重组腺病毒介导的人凝血Ⅸ因子cDNA在奶山羊乳腺中的分泌表达

利用含ｈＦＩＸｃＤＮＡ和腺病毒片段的质粒ｐＡｄＣＭＶｈＦＩＸ与质粒ｐＪＭ１７共转染２９３包装细胞，制备含ｈＦＩＸ的重组腺病毒颗粒，经纯化、浓缩后通过直接转染活体奶山羊乳腺小叶的方法，建立了ｈＦＩＸ蛋白的乳腺表达系统。转染处理４天后，ｈＦＩＸ蛋白在羊奶中的最高表达量为２１ｎｇ／ｍｌ乳汁，活性检测表明乳汁中的人凝血ＩＸ因子蛋白８０％以上具有生物学活性。此研究结果证实了人凝血ＩＸ因子全长ｃＤＮＡ在奶山羊乳汁中分泌表达的可行性，同时也为验证外源基因在奶山羊乳腺组织中的分泌表达提供了一个快速检测系统。

急性脑梗死患者蛋白C活性依赖凝固时间标准化比值降低

目的观察急性脑梗死患者蛋白C活性依赖凝固时间标准化比值(PCAT-NR)与相关凝血指标纤维蛋白原(Fib)、凝血因子Ⅶ活性(FⅦ:C)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)、抗凝血酶(AT)、D二聚体(DD)的相关性。方法经临床及影像学确诊急性脑梗死患者100例为病例组,选取75例体检健康者为健康人对照组,检测Fib、FⅦ:C、FⅧ:C、AT、PCAT-NR、DD并比较两组间差异;分析急性脑梗死患者PCAT-NR下降组与PCAT-NR正常组Fib、FⅦ:C、FⅧ:C、DD、AT结果差异;分析急性脑梗死患者PCAT-NR与其他凝血指标的相关性。结果急性脑梗死组Fib(3.38±1.25)g/L、FⅦ:C(130.5±15.9)%、FⅧ:C(135.8±43.1)%、DD(2.12±3.01)mg/L均高于健康人对照组,而AT(83.94±14.95)%、PCAT-NR(0.87±0.23)结果均低于健康人对照组,P均<0.05;急性脑梗死组患者PCAT-NR下降组Fib(4.03±1.25)g/L、FⅦ:C(138.2±6.9)%和FⅧ:C(151.5±54.9)%结果均高于正常组(P均<0.05),而DD、AT差异无统计学意义(P均>0.05);急性脑梗死患者PCAT-NR与Fib、FⅧ:C、DD呈负相关(r分别为-0.484、-0.356、-0.473,P均<0.05),与FⅦ:C、AT无相关性(P均>0.05)。结论急性脑梗死患者PCAT-NR水平下降与高凝状态有关,与Fib和凝血因子Ⅷ活性有一定关联。

大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为内皮细胞实验研究

目的探讨骨髓基质细胞 (BMSC)向内皮细胞分化的可行性。方法无菌条件下获取BMSC ,实验组以 40 0ng/ml重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)为诱导剂 ,进行体外诱导分化 ;对照组用 164 0培养液培养。 8d后进行免疫组化染色进行特异性内皮细胞标志物鉴定。结果分化后的细胞在光镜下具有内皮细胞的形态学特征 ;免疫组化染色证实实验组诱导后的细胞为内皮细胞。结论BMSC在高浓度rhGM CSF作用下 。

评价蔡氏公式用于接受Turoctocog alfa治疗的中国重型血友病A经治患者的准确性

目的在接受重组人凝血因子Ⅷ(rhFⅧ)Turoctocog alfa治疗的中国重型血友病A经治患者中评价蔡氏公式的准确性。方法纳入临床试验Guardian 7(NCT02938585)中国重型血友病A经治患者,均接受Turoctocog alfa 50±5 IU/kg单剂量输注,按不同年龄组(<12岁和≥12岁)方案抽取血样并采用显色法测定rhFⅧ半衰期T_(1/2)-G。根据基线和第3小时后2个时间点的FⅧ浓度,应用蔡氏公式计算T_(1/2)-C。基于由T_(1/2)-C计算的第Ⅲ相PK曲线,估算峰浓度(C_(max)⁃C)、第Ⅲ相任意时间点血药浓度(C_(t)⁃C)和增量回收率(IVR⁃C)。对由蔡氏公式计算得到的PK参数与实际PK参数进行配对Wilcoxon符号秩和检验、Pearson相关系数分析。结果共纳入17例经治患者(年龄3~44岁),其中15例患者的FⅧ浓度可用于蔡氏公式计算。T_(1/2)-C、C_(max)⁃C的标准差(s)相对于各自的平均值(X)均较小,T_(1/2)-C、C_(max)⁃C与实际检测的T_(1/2)⁃G、C_(max)⁃G柱状图均基本重合,T_(1/2)-C与T_(1/2)⁃G、C_(max)⁃C与C_(max)⁃G数据之间差异均无统计学意义(分别为P=0.2293和P=0.5591)且均有高相关性(分别为r=0.958和r=0.987;P<0.01)。蔡氏公式计算得到的第Ⅲ相PK曲线与实际检测的PK模拟曲线高度重合。结论在接受Turoctocog alfa治疗的中国重型血友病A经治患者中,蔡氏公式可用于计算第Ⅲ相PK曲线,对重型血友病A个体化预防治疗有一定指导作用。

重组人促红细胞生成素对人脐静脉内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达影响

目的研究重组人促红细胞生成素(rHuEPO)调节体外培养内皮细胞参与血管生成机制。方法从人脐静脉体外分离培养内皮细胞(HUVEC),采用形态学观察及血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)免疫组织化学方法检测进行内皮细胞鉴定,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测HUVEC同源盒HoxB2及HoxD3基因mRNA表达变化。结果与对照组比较,rHuEPO可明显上调内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 rHuEPO可调节内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达,这种调节作用可能是其促血管生成的主要原因之一。