Expression,purification and immunocharacteristics of recombination UreB protein of H.pylori

INTRODUCTIONHelicobacter pylori (H . pylori) is associated with the development of chronic gastritis ,peptic ulcer and gastric cancer and gastric MALT lymphoma[1-9],H .pylori has many antigens ,including urease ,heat shock protein and vacuolating cytotoxin and so on ,and urease is an important factor in the colinization of the gastric mucosa and suspected to cause damage to the gastric mucosa[10-14].At the same time ,urdase is also one of the important protective antigens .

重组蛋白质纯化技术

90年代以来 ,基因重组技术得到很大的发展 ,基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的 6 0 %～ 80 %,因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。着重介绍了扩张柱床吸附层析技术 ,径向膜层析技术 ,灌注层析技术 ,液液萃取技术 ,置换层析技术和金属螯合亲和层析技术近年来进展情况以及它们的优缺点和应用范围。

重组人TGF-β1融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的原核表达载体,表达并纯化GST-hTGFβ1.方法应用RT-PCR获得人TGF-β1的基因片段,成功构建人TGF-β1原核表达载体,诱导表达人TGF-β1与GST的融合蛋白;应用亲和层析法纯化重组融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析.结果成功构建了人TGF-β1重组融合表达质粒pGEX-4T-1-TGF-β1,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGF-β1抗体特异性的结合能力.结论成功构建了人TGF-β1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物,为下一步的人TGF-β1自体疫苗的研制奠定了基础.

大肠杆菌中重组GNA蛋白的分离纯化

具有特异结合甘露糖基的雪花莲外源凝集素 (Galanthusnivalisagglutinin,GNA)具有多种生物活性 ,在糖蛋白分离、逆转录病毒病和害虫防治等方面有广泛的应用价值。该试验分别采用超声破碎法、冻融裂解法和溶菌酶法破碎重组大肠杆菌细胞后 ,经尿素或SKL(十二烷基肌氨酸钠水溶液 )溶解后 ,再透析复性获得了在大肠杆菌 (E .coli)中高效表达的重组GNA蛋白 ,并经SDS -PAGE电泳检测GNA的大小、浓度及表达量。通过对诱导表达时间、超声处理的功率、时间、模式、尿素和SKL洗涤浓度 ,透析条件的优化组合 ,建立了一套从大肠杆菌细胞中分离重组GNA蛋白的有效方法 ,为进一步的重组GNA生物活性试验提供了物质基础。

疫苗分离纯化研究进展

综述了国内外关于疫苗分离纯化的研究进展 ,系统介绍了目前可用作各类疫苗 (尤其是基因工程疫苗 )分离纯化的方法。沉淀和离心等传统分离技术在各类疫苗的分离纯化中应用广泛 ,层析技术和其它分离技术的结合已成为疫苗分离纯化的主流 ,新型膜技术和亲和层析在基因工程亚单位疫苗分离纯化中的作用引人注目。

乳源抗菌-免疫调节融合蛋白原核表达和纯化

目的构建乳铁蛋白抗菌肽(LfcinB)与免疫调节肽(PGPIPN)融合肽表达质粒,并在大肠杆菌BL21中表达及纯化。方法采用重叠延伸PCR技术获得融合肽基因片段,并构建到原核表达载体pGEX-KG中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。用Glutathione Sepharose4B亲和层析方法纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pGEX-KG-FP,并在大肠杆菌BL21中诱导其高表达。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗GST单克隆抗体所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。经Glutathione Sepharose4B纯化后,得到较纯的GST-FP融合蛋白。结论构建了原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该融合蛋白。

重组大鼠细胞球蛋白的制备、纯化与活性

通过聚合酶链式反应(PCR)克隆鼠源细胞球蛋白(Cytoglobin,CYGB)基因,构建原核表达载体pET22b-Cygb,转入E.coliBL21(DE3)经乳糖诱导表达CYGB,发现CYGB主要以可溶形式存在,其表达量占可溶性总蛋白的35%以上.通过DEAE阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,CYGB纯度可超过95%.重组表达的可溶性CYGB不但具有过氧化物酶活性,其活性为(3.23±0.12)mkat.(g.min)-1,还能保护胎鼠原代皮肤成纤维细胞减轻氧化应激损伤(H2O2模型).

重组粘质沙雷氏菌几丁质酶C的纯化及酶学性质

为从已构建的重组大肠杆菌pET-22b-chiC获得高纯的几丁质酶C,通过降低培养温度,提高粘质沙雷氏菌几丁质酶C的可溶性表达.表达产物经镍柱亲和层析(IMAC)和Phenyl-Sepharose疏水层析(HIC)分离纯化后,得到电泳纯的几丁质酶.酶学性质研究表明,纯化的几丁质酶C为单体蛋白,相对分子质量为51.8ku;最适pH值为5.0,最适温度为55℃,在55℃的条件下保温4 h后仍有90%以上的酶活力.研究结果还表明,Cu2+,Hg2+,Co2+,Mg2+对酶活力均有明显抑制作用,而Fe2+,Zn2+,Sn2+,Ba2+对酶活力有一定促进作用,Mn2+对酶活力明显促进作用.

重组沙蚕激酶的诱导表达和分离纯化

将已构建好的表达载体pGEX-4T-2SAK转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合的沙蚕激酶蛋白,通过GST树脂亲和吸附和凝血酶酶切及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,用SDS-PAGE分析要重组的目的蛋白及纯化后的蛋白。纯化后的沙蚕激酶经纤维平板法测定具有溶栓活性。冷冻干燥品经SDS-PAGE分析表明达到电泳纯。

重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE30中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行TricineSDSPAGE电泳分析和WesternBlot检测分析.结果构建了重组融合表达质粒pQE30Tum5,表达的蛋白经TricineSDSPAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.

家蚕血淋巴液中重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的制备纯化及鉴定

为探索适于昆虫表达体系重组蛋白质的分离、纯化方法，对家蚕细胞表达的重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）的纯化工艺进行了研究。利用离子交换色谱、凝胶过滤色谱及旋转等电聚焦电泳等技术，建立了从家蚕血淋巴液中分离、纯化ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的工艺路线。经过三步分离，获得了纯度为９７．２４％的目标产品，总回收率达３３．５９％。此法可有效地去除动、植物色素且简单、经济、高效，适于进行规模放大，为ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的大规模制备及临床应用打下了基础。

重组人干细胞因子中试工艺研究

人干细胞因子(Human stem cell factor,hSCF)是一种重要的造血细胞因子,能刺激造血细胞的生长、增生与分化.本文在重组hSCF工程菌的基础上,通过高密度发酵培养、包涵体分离纯化、变复性、SP-Sepharose FF、Source 30RPC与Q-Sepharose FF层析等技术分离纯化出具有生物学活性的重组人干细胞因子,建立了适合大规模生产重组人干细胞因子的分离纯化工艺.纯化的rhSCF纯度达98%以上,生物活性为1·0×106IU/mg,各项质量检测指标均符合质量控制标准.该纯化工艺简单易行,一批次能制备克级样品,且产品回收率高,重复性好.

布鲁菌外膜蛋白OMP25的原核表达

为了克隆布鲁菌外膜蛋白OMP25基因并构建基因的原核表达系统,试验采用聚合酶链反应(PCR)扩增得到布鲁菌基因组OMP25基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列,将目的基因定向插入原核表达载体pET-32a,经双酶切和DNA测序,再将构建的重组质粒转化到E.coilDH5α、Rosetta,经IPTG诱导后用SDS-PAGE检测重组蛋白pET32a-OMP25的表达情况。结果表明:经DNA测序显示OMP25基因序列和插入位点正确,成功构建了重组质粒pET32a-OMP25,经IPTG诱导表达出以包涵体形式存在的长为43 ku的OMP25融合蛋白;经Western-blot检测,OMP25融合蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。

大肠杆菌表达的重组人BMP-2和hBMP-4成熟肽大规模制备方法的比较

目的:大规模制备人骨形成蛋白成熟肽(hBMP-m):hBMP-4m和hBMP-2m.方法:两种工程菌株分别含有能够高表达hBMP-4m和hBMP-2m的质粒,分别导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,离心收集菌体,悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次.预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体分别用8 mol/L尿素缓冲液溶解,上Sepharose SP-FF阳离子柱.结果:发酵菌液A600 nm值分别为28.8和26.3.SOS-PAGE电泳后吸光度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的40.0%,hBMP-2m占细菌总蛋白量的47.2%.洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的82.9%,hBMP-2m占蛋白量的84.5%.上Sepharose SP-FF阳离子柱后,分别收集0.35 mol/L NaC l和0.20 mol/L NaC l洗脱部分,获得纯度为96%的hBMP-4m及纯度为95%的hBMP-2m.其收获量分别为1.30 g/L发酵液和1.25 g/L发酵液;收得率分别为34.33%和34.81%.结论:大规模制备hBMP-4m和hBMP-2m时,使用相同的发酵程序及相近的纯化方法,都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度.

利用pET-29b载体进行葡激酶基因表达与其产物的亲和纯化

目的 :探讨 6聚组氨酸序列与葡激酶基因序列融合表达及其表达产物的纯化方法。方法 :将葡激酶的c DNA序列连入 p ET- 2 9b质粒 ,转入 E.coli BL 2 1(DE3)进行表达。应用镍金属离子螯合层析及凝胶过滤层析法纯化表达产物 ,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果 :6聚组氨酸与葡激酶的可溶性融合蛋白在 BL 2 1(DE3)中的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的 2 5 % ;螯合层析纯化后其纯度可达 90 %以上 ;再应用 Sephacryl S-2 0 0 HR可使其纯度提高到 98%以上 ;测得其比活性为 5 .0× 10 4 AU· m g- 1 。结论 :利用 p ET- 2 9b载体成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的亲和纯化。

牡蛎过敏原肌浆钙结合蛋白的分离纯化和鉴定

利用质谱鉴定从太平洋牡蛎肌浆里提取的单一蛋白,通过免疫印迹分析诱导表达的重组蛋白和之前已鉴定的天然蛋白的分子质量一致性,利用圆二色光谱分析两蛋白在二级结构上的一致性,鉴定牡蛎肌浆钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)糖蛋白类型并测定其多糖含量。结果表明,从牡蛎粗提物中纯化20 kDa蛋白,经LC-MS/MS证实为牡蛎肌浆钙结合蛋白SCP;电泳得到天然SCP和重组SCP分别为20 kDa和22 kDa的条带;测定二者α螺旋和β折叠含量分别为13.5%、18.9%以及14.5%、18.2%;SCP蛋白含O-糖苷键型糖多糖,含量为7.89%。重组SCP与天然SCP除分子质量稍有差异外,二者空间结构近乎相同,是太平洋牡蛎中新型潜在致敏原。该研究为今后用重组SCP替代天然SCP进行致敏性和致敏机制研究奠定了基础。

人PSMP重组蛋白在CHO细胞中表达、纯化及功能鉴定

目的:构建新的具有趋化作用的人类细胞因子PSMP的真核表达载体,在仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中表达并纯化,为PSMP的功能机制研究奠定基础。方法:从pcDNA3.1-PSMP-myc/His中切下PSMPmyc/His片段,插入pMH3表达载体。利用电穿孔法将该表达载体转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定克隆株。以Dot blot及Western blot法检测上清液中PSMP蛋白的表达,利用有限稀释法对抗性筛选出的混合克隆单克隆化,悬浮无血清大批培养工程细胞,通过镍亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度,Boyden小室体外趋化实验分析蛋白功能活性。结果:PSMP-myc/His基因插入pMH3载体后成功构建真核表达载体pMH3-PSMP,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达PSMP的基因工程细胞株。镍亲和层析纯化的重组蛋白PSMP纯度达95%以上且具有生物学活性。结论:成功构建了PSMP蛋白的真核表达载体,并获得其稳定表达的CHO细胞株,获得了较高纯度的、具有生物学活性的重组蛋白,为下一步PSMP功能和机制研究提供有用工具。

重组大豆7S球蛋白α′-亚基的分离纯化

为分离及纯化重组大豆7S球蛋白(β-conglycinin)α′-亚基,将大肠杆菌工程菌pET-28a-α′-BL21经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,得到含有重组7S球蛋白α′-亚基目的蛋白的菌液,再经超声破碎、离心得到粗提的重组蛋白。采用AKTA蛋白纯化系统利用Ni 2+亲和层析柱进一步纯化重组蛋白,当采用流速为5mL/min的平衡液平衡Ni 2+柱可以得到较高纯度的目的蛋白,纯度可达89.1%。

Triton X-114用于去除内毒素的研究

目的探讨规模化生产原核表达重组蛋白的Triton X-114去除细菌内毒素的方法与效果。方法以大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b、重组人生长激素、重组葡激酶蛋白粗提液为原料,采用反复抽提相分离法,研究Triton X-114去除细菌内毒素的效果。结果经一次Triton X-114抽提,能够去除蛋白粗提液中95%的细菌内毒素,蛋白收率保持85%以上,蛋白性质不受影响。结论 Triton X-114反复抽提相分离法能够有效地去除细菌内毒素,适合于规模化原核重组蛋白的生产。

rhBMP-2m在高浓度条件下的复性

目的:优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽(rh-BMP-2m)的复性条件.方法:将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH,氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性.透析复性后进行非还原的SDS-PAGE,检测rhBMP-2m活性形式二聚体的含量,同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22μm微孔滤膜除菌并计算其损失率.结果:经透析复性后rhBMP-2m完全可溶,而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右,即复性后二聚体的rhBMP-2m可以达到每升发酵液800 mg,并且经微孔滤膜除菌后rhBMP-2m活性形式二聚体的含量基本没有损失,同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%.结论:高pH有利于rhBMP-2m的复性,除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP-2m复性后仍保持可溶.蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大,但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大.