芹菜素通过组成性激活JNK敏化TRAIL诱导HeLa细胞凋亡

目的研究芹菜素(API)与重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TR AIL)合用对人宫颈癌H eLa细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制是否涉及组成性激活JN K。方法体外培养人宫颈癌H eLa细胞。碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FC M)定量分析亚二倍体细胞(sub-G 1)百分率。比色法测定细胞C aspase-3活性。D N A琼脂糖凝胶电泳观察细胞D N A梯形条带。W estern Bloting检测细胞蛋白的表达。结果 API(20μm ol/L)和TR AIL(20ng/m L)以及两者合用作用48 h的人宫颈癌H eLa细胞系sub-G 1百分率分别是(3.56±0.20)%、(6.69±0.40)%和(59.87±4.20)%;H eLa细胞C aspase-3的活性分别是培养基对照组的1.4、1.5和39倍。D N A琼脂糖凝胶电泳显示:20μm ol/LAPI与20 ng/m L的TR AIL联合处理,展示出典型D N A梯形条带图谱,C aspase-3抑制剂zD EVD-fm k能够消除API和TR AIL合用促细胞凋亡作用。API以浓度依耐方式增高H eLa细胞JN K蛋白磷酸化水平。JN K特异性抑制剂SP600125能阻断API激活JN K,并抑制API增强TR AIL促细胞凋亡作用。结论芹菜素敏化TR AIL诱导细胞凋亡作用与其组成性激活JN K有关。

重组可溶性人 CD40L 诱导人脐静脉内皮细胞损伤

目的：探讨重组可溶性人CD40L（ rshCD40L）对人脐静脉内皮细胞（ HUVECs）的损伤作用及其在动脉粥样硬化中的作用。方法：应用rshCD40L刺激人脐静脉内皮细胞12 h；MTS法观察HUVECs的生存活性， ELISA法测内皮细胞E－选择素（ E－selectin）、细胞间黏附分子（ ICAM）－1、组织因子（ TF）、组织因子途径抑制物（ TF－PI）表达的变化，比色法测脂质过氧化物丙二醛（ MDA）含量及超氧化物歧化酶（ SOD）活力。结果：与正常组比较，不同浓度的rshCD40L（0．5、1、2、3 mg／L）对内皮细胞的生存活性无明显影响；0．5 mg／L rshCD40L即可增加内皮细胞E－selectin、sICAM－1、TF、TFPI的分泌，差异有统计学意义（ P＜0．01），同时增加内皮细胞MDA的含量、降低SOD活性（P＜0．05）。结论：0．5～3 mg／L rshCD40L对内皮细胞生存活性无明显影响，但已经引起内皮细胞功能障碍，增加内皮细胞炎症和外源性凝血反应，诱导内皮细胞脂质过氧化物损，使其抗氧化能力下降。

毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。

重组人血管内皮抑制素联合顺铂化疗方案对中晚期非小细胞肺癌患者外周血sPD-L1、CEA水平的影响

目的探讨重组人血管内皮抑制素注射液（恩度）联合顺铂化疗方案对中晚期非小细胞肺癌患者外周血可溶性程序性死亡配体-1（sPD-L1）、癌胚抗原（CEA）水平的影响。方法选取2014年2月—2015年2月四川大学华西医院肿瘤科收治的100例中晚期非小细胞肺癌患者为研究对象,按随机数字表法分为对照组和观察组各50例。对照组采用紫杉醇、顺铂静脉注射,观察组在对照组基础上给予恩度注射液。观察对比2组患者临床疗效、sPDL1、CEA水平、生存质量改善情况和不良反应。结果观察组近期总有效率68.0%（34/50）优于对照组18.0%（9/50）,差异具有统计学意义（P〈0.05）;与治疗前比较,2组治疗后sPD-L1、CEA均明显降低（P〈0.05）,且观察组sPD-L1低于对照组[（1.21±0.36）ng/ml vs.（1.50±0.40）ng/ml,t=3.811,P〈0.05],CEA亦低于对照组[（10.24±3.02）ng/ml vs.（15.78±4.21）ng/ml,t=7.561,P〈0.05];观察组生存质量总改善率优于对照组[80.0%（40/50）vs.38.0%（19/50）,χ^2=18.231,P〈0.05];观察组不良反应总发生率低于对照组[10.0%（5/50）vs.34.0%（17/50）,χ^2=8.392,P〈0.05]。结论恩度联合顺铂化疗方案对中晚期非小细胞肺癌患者有显著效果,且不增加化疗的不良反应,安全性好。

利用盘基网柄菌表达可溶性人Fas配体

用PCR扩增从激活的人中性粒细胞中得到的编码可溶性Fas配体胞外区中第14 1个到第2 81个氨基酸的cDNA ,将其与hCG_β信号肽片段融合到质粒MB12neo中,随后导入到盘基网柄菌AX3细胞中,得到分泌性表达hFasL的重组菌AX3_H3。为提高shFasL的表达量,对质粒pMB12neo作了改造,得到衍生质粒pMB74。利用质粒pMB74克隆表达shFasL ,得到高通量表达shFasL的重组菌AX3_pLu8。在复杂培养基HL_5C中,重组菌的细胞密度可达(1 5～2 )×10 7 mL ,AX3_H3及AX3_pLu8分泌的shFasL浓度分别为2 3 5 μg L及2 0 6 μg L。利用合成培养基SIH培养重组菌AX3_H3及AX3_pLu8,细胞密度均达到(4～5 )×10 7 mL ,shFasL浓度则分别达到111μg L和4 2 0 μg L。

重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体纯化中试工艺研究

目的摸索一条适合重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的中试分离纯化工艺。方法发酵后菌体经洗涤、超声破碎和2步盐析等预处理后,经过3步色谱纯化,对最终蛋白质进行纯度、内毒素和活性检测。结果目的蛋白质纯度达98%以上,生物活性为4.8×107-6.94×107U/mg,热原符合标准。最终1L发酵液经过分离纯化,可以得到目的蛋白质200mg以上。结论此工艺纯化收率高,蛋白质纯度高,生物活性好,重复性好,适合工业化生产。

重组可溶性TRAIL冻干保护剂的初步筛选

目的筛选出适合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)冻干制剂的保护剂。方法在TRAIL蛋白中加入不同浓度配方的甘露醇、清蛋白和乳糖,经过冷冻干燥,观察冻干制剂的色泽、外观、溶解度和澄明度,并且测定冻干制品的水分和生物学活性,筛选出最佳保护剂。结果初步筛选出2%甘露醇+3%乳糖作为TRAIL蛋白的保护剂。结论TRAIL蛋白药物加入该保护剂后,外观、溶解度、澄明度及生物活性都比较好。在不同温度,对TRAIL蛋白生物活性有很好的稳定作用。

急性冠脉综合征患者血清sCD40L和MMP-9水平变化与危险分层的相关性研究

为了弄清急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)患者血清重组人可溶性CD40配体(recombinant human soluble CD40 ligand, s CD40L)和金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)水平变化与危险分层的相关性,本研究随机选取20例健康志愿者和60例就诊的ACS患者,将ACS患者根据危险分层GRACE评分系统分为3组(低危组,中危组和高危组),每20例。测定并统计各组间血清s CD40L和MMP-9水平变化,分析与危险分层的相关性。研究结果表明,低危组、中危组和高危组ACS患者血清s CD40L和MMP-9水平均明显高于对照组(p<0.05),而高危组差异与对照组更显著(p<0.01),且ACS患者血清s CD40L (r=0.867)和MMP-9 (r=0.725)水平与危险分层分数呈正相关性关系。ACS患者血清s CD40L和MMP-9水平与危险分层分数呈正相关性关系,这些数据将为今后临床防治ACS提供更可靠的支撑。

重组人Flt3配体在毕氏酵母中的表达及其对恶性造血细胞的体外作用

目的 用毕氏酵母 (Pichiapastoris)表达人可溶性Flt3配体 (rhFL) ,并观察rhFL对恶性造血细胞增殖的作用 ;探讨地塞米松 (DXM)对Flt3受体 (Flt3R)表达及rhFL介导的恶性造血细胞增殖的影响。方法 人工合成FL基因片段 ,经基因重组技术获得重组质粒pPICZα FL ,电转化毕氏酵母 ,筛选分泌rhFL的基因工程菌株。用流式细胞仪测定恶性造血细胞表面Flt3R的表达 ,用MTT法分析rhFL对恶性造血细胞的增殖作用及DXM的影响。结果 经筛选 ,获得稳定分泌rhFL的基因工程菌株 ,表达量达 30mg/L。rhFL在 10～ 10 0ng/ml时 ,刺激Raji和HL 6 0细胞的增殖 ,但对绝大多数的恶性造血细胞无刺激作用 ;18株恶性造血细胞株中 5株细胞表达Flt3R ;对部分病理类型的白血病新鲜标本的研究发现 ,6 0 %患者的外周血或骨髓细胞表达Flt3R ,急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病患者Flt3R的阳性率较高 ,但仅有部分患者的白血病细胞在体外对FL的刺激有增殖效应。DXM可抑制rhFL对Raji、HL 6 0细胞及部分新鲜白血病标本的白血病细胞的刺激增殖作用。结论 应用毕氏酵母表达具有生物学活性的rhFL ,rhFL可刺激Raji、HL 6 0和部分白血病患者白血病细胞在体外的增殖。DXM通过降低Flt3R的表达 ,抑制rhFL介导的恶性造血细胞的增殖。

芹菜素增强TRAIL诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡

目的:研究芹菜素(API)与重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)合用对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。方法:体外培养人宫颈癌HeLa细胞。碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)定量分析sub-G1百分率。DNA琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA梯形条带。结果:API(20μmol/L)和TRAIL(20ng/mL)以及两者合用作用48h的人宫颈癌HeLa细胞sub-G1百分率分别是3.56%±0.20%、6.69%±0.40%和59.8%±4.20%;DNA琼脂糖凝胶电泳显示:20μmol/LAPI与20ng/mL的TRAIL联合处理,展示出典型DNA梯形条带图谱。结论:芹菜素具有增强TRAIL诱导HeLa细胞凋亡作用。

PCI治疗对急性冠脉综合征患者血浆可溶性CD40配体及基质金属蛋白酶-9的影响

为了分析经皮冠动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)对不同年龄组急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血清重组可溶性CD40配体(recombinant soluble CD40 ligand,sCD40L)和金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)水平的影响。本研究随机选取40例健康志愿者、就诊的40例急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)和40例不稳定心绞痛(unstable angina pectoris,UAP),按年龄≤60岁为一组,>60岁为一组,每组20例。分别在PCI治疗前1 d、治疗后1 d和7 d测定并统计各组间血清sCD40L和MMP-9水平变化。ACS患者血清sCD40L和MMP-9水平均明显高于对照组(p<0.05);>60岁的ACS患者血清sCD40L水平略高于≤60岁患者,但是无显著性差异(p>0.05);PCI治疗1 d后可增加ACS患者的血清sCD40L和MMP-9水平(p<0.01),7 d后则逐渐下降。ACS患者的血清sCD40L和MMP-9水平变化与年龄无明显关系;PCI治疗可能加重了冠状动脉内早期炎症,致使血清sCD40L和MMP-9水平在短期内增加,后期则逐渐恢复正常。

芹菜素敏化TRAIL诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡

目的:研究芹菜素(API)是否具有敏化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡作用。方法:体外培养CoC1细胞。碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)定量分析sub-G1细胞百分率。ELISA法测定细胞Caspase-3活性。结果:API(20μmol/L)和TRAIL(20ng/mL)以及两者合用48h的sub-G1细胞百分率分别是8.83%±2.33%、8.32%±2.80%和69.50%±4.65%;人卵巢癌CoC1细胞Caspase-3的活性分别是培养基组的1.3、1.4和6.5倍。结论:亚细胞毒性浓度的芹菜素具有增强TRAIL诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡作用。

联合索拉非尼与TRAIL对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响

目的:研究多激酶抑制剂甲苯磺酸索拉非尼(SOR)是否具有增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡作用。方法:体外培养HT-29细胞。碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)定量分析亚二倍体(sub-G1)细胞百分率。比色法测定细胞Caspase-3活性。AO/EB双染色荧光显微镜观察凋亡细胞形态。结果:SOR(5μmol/L)和TRAIL(100ng/mL)以及两者合用作用48小时HT-29细胞的sub-G1百分率分别是4.65%±2.33%、5.29%±2.80%和42.6.50%±4.65%;HT-29细胞的Caspase-3的活性分别是培养基组的1.24、1.37和9.51倍。两者合用展示出细胞核染色质固缩和碎裂的典型凋亡细胞形态。结论:亚细胞毒性浓度的SOR具有增强TRAIL诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡作用。