SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并获得SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD并通过各项试验证明其安全性和免疫原性。

HIV-1复制型DNA疫苗与非复制型重组痘苗病毒疫苗在小鼠体内细胞免疫效果的研究

目的:用HIV-1复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗(rNTV-C)进行单独免疫和联合免疫的研究(2种疫苗分别包含HIV-1 B'/C亚型的gp160、gag-pol、rev-tat-nef等6种基因),以了解这2种新型HIV疫苗单独免疫及联合免疫的效果,并为临床免疫方案的制定提供实验依据。方法:将HIV-1 DNA疫苗和rNTV-C疫苗免疫BALB/c小鼠,设计rNTV-C单独免疫组、DNA单独免疫组,以及DNA初免、rNTV-C加强的联合免疫组,并设计不同免疫途径和不同剂量的各种组合。用IFN-γELISPOT检测各组的细胞免疫效果,用统计学方法分析比较各组细胞免疫效果的差异。结果:DNA疫苗和rNTV-C疫苗单独免疫时,二者都能诱发针对各抗原的特异性免疫反应;联合免疫能够诱发比DNA或rNTV-C单独免疫都强的特异性细胞免疫反应。统计分析显示,2种疫苗采用肌肉注射途径的免疫效果显著高于皮内注射,1μg和5μg DNA疫苗的免疫效果差异不显著,而1×108 PFU的rNTV-C比2×107PFU的免疫效果要强。结论:联合免疫策略能够显著增强HIV-1疫苗各抗原的免疫原性,通过对2种HIV-1疫苗单独免疫及二者联合免疫的细胞免疫反应的分析比较,确定了较好的免疫方案,为疫苗临床前免疫效果评价和临床方案的制定提供了实验依据。

表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒的初步应用

目的:制备表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒,并初步探讨其应用。方法:构建制备表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒RVJ11LacZ-I1LGFP;分别利用药物昔多福韦与抗痘苗病毒高效价免疫血清,建立基于该病毒的荧光生成抑制实验及荧光减数中和实验。结果:荧光生成抑制实验与传统的噬斑生成抑制实验相比,结果一致,但判读更直接快速;重组痘苗病毒RVJ11LacZ-I1LGFP亦可用于体外快速高通量评价正痘病毒疫苗的中和能力。结论:利用表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒建立了直接简便快速高通量的抗痘病毒药物筛选及体外中和评价技术。

天坛株痘苗病毒基因缺失弱毒株的构建及鉴定

本研究旨在通过敲除部分与天坛株痘苗病毒(vaccinia virus Tiantan strain,VTT)毒力和宿主范围等相关的复制非必需基因,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术,构建多基因缺失VTT弱毒株。人工合成7对重组臂,结合痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein,EGFP),构建穿梭载体质粒pTC-EGFP、pTA35-EGFP、pTA66-EGFP、pTE-EGFP、pTB-EGFP、pTI-EGFP和pTJ-EGFP。将上述质粒依次与VTT或基因缺失VTT共转/感染BHK细胞,并通过同源重组和荧光蚀斑筛选方法,逐一敲除拟缺失基因片段(TC:TC7L^TK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13R^TB14R;TI:TI4L;TJ:TJ2R)。利用Cre/Loxp系统实现对外源筛选标记的敲除,最终获得天坛株痘苗病毒基因缺失弱毒株TTVAC7,并运用PCR方法对TTVAC7进行鉴定和遗传稳定性检测。结果表明,本研究成功构建了缺失7个目的片段的天坛株痘苗病毒弱毒株TTVAC7,且该弱毒株具有良好的遗传稳定性。

人禽流感病毒H5N1多价重组痘苗病毒（天坛株）疫苗在小鼠中的免疫原性研究

目的 研发高效广谱的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗.方法 首先构建了含H5N1（安徽株）结构基因[血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白M1与M2]的两个双顺反子（HAop/M2,NAop/M1）重组痘苗病毒（rTTV天坛株）疫苗,采用不同剂量（104 PFU或107PFU）或组合（疫苗单独或联合）方式于0、4周二次免疫BALB/c小鼠,初步比较分析抗原特异的体液（HA血凝抑制抗体、NA特异性抗体、中和抗体）与细胞免疫应答（IFN-γ ELISPOT）特点.结果 重组痘苗病毒疫苗可有效表达H5N1靶抗原;高剂量组的重组痘苗病毒疫苗可快速激发较强的针对各个抗原的抗体与针对血凝素与神经氨酸酶蛋白的细胞免疫应答,含血凝素蛋白的重组痘苗病毒疫苗亦可诱导明显的中和抗体;但各组重组痘苗病毒疫苗所激发的针对基质蛋白（M1,M2）的细胞免疫应答均较弱;两个双顺反子（HAop/M2,NAop/M1）重组痘苗病毒疫苗联合应用所激发的针对基质蛋白2（M2）的体液免疫应答明显强于单双顺反子（HAop/M2）疫苗单独应用.结论 本研究中制备的各组重组痘苗病毒疫苗可诱导多个抗原特异的体液与细胞免疫应答,该研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化奠定了基础.

H5N1DNA疫苗与重组痘苗病毒疫苗在小鼠中不同联合免疫方案对免疫原性的影响

目的：本研究旨在优化人高致病性禽流感病毒H5N1重组DNA疫苗与重组痘苗病毒疫苗联合应用的免疫方案。方法我们将前期制备的含H5N1（安徽株）结构基因的两种重组DNA疫苗（分别基于pVRC与pIRES载体骨架）及一种重组痘苗病毒（天坛株）疫苗，采用不同初免方式联合免疫BALB/c小鼠，比较分析抗原特异的体液[血凝素（hemagglutinin，HA）抑制抗体（HAI）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）特异性抗体、中和抗体]与细胞免疫应答（IFN-γELISPOT）特点。结果H5N1重组DNA疫苗初免、H5N1重组痘苗病毒疫苗加强的联合免疫可激发较强的体液与细胞免疫应答；其中H5N1重组DNA疫苗皮内电转初免组比肌肉电转初免组诱导的中和抗体更高。此外，基于pVRC载体的H5N1重组DNA疫苗初免诱导的HAI抗体及NA特异的细胞免疫均高于基于pIRES载体的DNA疫苗初免组；基于pVRC载体的H5N1重组DNA疫苗肌肉注射电转初免组诱导的HA特异的细胞免疫亦高于基于pIRES载体的H5N1重组DNA疫苗。结论各组H5N1重组DNA疫苗与重组痘苗病毒疫苗联合应用可诱导多个抗原特异的体液与细胞免疫应答，不同联合免疫方案对免疫原性的影响显著。该研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化应用奠定了基础。

缺失TA35R基因减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选

通过敲除痘苗病毒天坛株(vaccinia virus tiantan strain,VTT)复制非必需基因TA35R,结合双筛选标记及同源重组技术,构建TA35R基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TA35R-。人工合成含有TA35R重组臂、同向loxp序列、早晚期启动子PE/L、EGFP及酶切位点的穿梭质粒pTA35R-EGFP。pTA35R-EGFP和野生型VTT共转染BHK-21细胞,通过绿色荧光蚀斑筛选,构建缺失TA35R基因且含FGFP基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R--EGFP+。采用Cre/Loxp系统敲除外源筛选标记EGFP,获得缺失TA35R基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R-,利用PCR方法和电子显微镜对其进行鉴定,通过MTT法检测细胞噬性以评价其减毒效果。结果表明,所构建的痘苗病毒弱毒株rVTT-TA35R-完全缺失了TA35R基因和外源筛选标记EGFP,且细胞毒性减弱。

重组痘苗病毒TTVAC7理化特性

探讨重组痘苗病毒TTVAC7的理化特性,对重组痘苗病毒活载体疫苗的规模化生产、保存、运输和净化具有一定的指导意义。将重组痘苗病毒TTVAC7和天坛株痘苗病毒VTT经热、酸、碱、乙醚、氯仿、胰蛋白酶、紫外线照射及超声波破碎处理后,接种于BHK-21细胞,通过测定TCID50观察上述理化因子处理前后TTVAC7和VTT毒价的变化,并分析这些理化因子对TTVAC7和VTT的影响。结果显示,TTVAC7经55℃作用15min,VTT经55℃作用30min即可完全被灭活;在pH值3~9的范围内,pH值的变化不会引起TTVAC7和VTT病毒滴度的显著变化;紫外线垂直距离10、30cm照射病毒液60min,不能完全灭活病毒粒子;对氯仿敏感;经1%胰蛋白酶37℃处理60min,TTVAC7和VTT的病毒滴度下降2个滴度以上;对乙醚不敏感;经40、80Hz的非接触式超声处理60min,TTVAC7和VTT的病毒滴度下降低于2个滴度。结果表明,重组痘苗病毒TTVAC7和天坛株痘苗病毒VTT理化性质相似,均不耐高温,耐酸、碱、乙醚、紫外线及超声波,对氯仿和胰蛋白酶敏感。

E3L基因缺失型痘苗病毒的构建

目的构建E3L基因缺失型痘苗病毒,并评价其毒力和安全性。方法根据天坛株痘苗病毒全基因组设计合成以E3L基因为重组臂,并含有Loxp序列、早晚期复合强启动子(PE/L)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、终止信号(T5nT)的重组痘苗病毒穿梭质粒pVTTΔE3L-EGFP,然后利用同源重组和Cre/Loxp系统构建E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L。检测VTTΔE3L对BHK-21、HEK-293、OA3.TS、Marc-145和DF-1细胞存活率的影响并测定其在上述细胞中的一步生长曲线,初步明确VTTΔE3L的毒力和复制能力;连续传代40代,检测VTTΔE3L的遗传稳定性;滴鼻感染BALB/c小鼠,检测其对小鼠体重变化的影响,初步明确VTTΔE3L的安全性。结果利用EGFP筛选标记和Cre/Loxp特异性敲除系统,通过多次挑斑筛选获得了E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L,且PCR鉴定VTT目的条带大小为359bp,rVTTΔE3L-EGFP目的条带大小为1206bp。结晶紫染色图表明VTTΔE3L对BHK-21细胞的抑制作用明显弱于VTT,通过连续传代40代,PCR没有检测到重组痘苗病毒VTTΔE3L的目的条带,确定了VTTΔE3L具备良好的遗传稳定性。细胞生存率检测表明随作用时间的延长VTTΔE3L对不同株细胞的杀伤作用显著低于VTT,在48h和72h时VTTΔE3L与VTT对不同细胞的抑制作用存在显著性差异(P<0.01)。VTTΔE3L在受试细胞中的一步生长曲线表明VTTΔE3L的复制能力未受到明显影响。体内试验表明BALB/c小鼠接种第9d开始,VTT组小鼠体重开始迅速下降且显著低于PBS组和VTTΔE3L组(P<0.01),而VTTΔE3L组和PBS组小鼠体重并未受到影响且两者无显著性差异(P>0.05)。结论成功获得E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L,其安全性良好,为以痘苗病毒为载体的疫苗研究和临床应用奠定了基础。