化学分子伴侣对重组绵羊IFN-tau在大肠埃希菌中可溶性蛋白表达的影响

为探索化学分子伴侣对重组绵羊胚胎干扰素(roIFN-tau)在大肠埃希菌中可溶性蛋白表达的影响,以oIFN-tau cDNA为模板PCR法扩增oIFN-tau成熟肽基因后,扩增产物和pBV221表达载体分别用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶双酶切、连接,构建表达载体,并进行双酶切和测序鉴定。用不同浓度的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、β-环糊精、蔗糖、D-甘露醇、二甲基亚枫、乙醇)于42℃诱导阳性重组菌表达4 h,分别取E.coli上清和沉淀做SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析结果表明,甘油、葡萄糖、β-环糊精、蔗糖、二甲基亚砜对oIFN-tau的表达形式没有影响,而D-甘露醇和乙醇增加了oIFN-tau的可溶性表达,为进一步的功能研究奠定了基础。

重组CE18蛋白在绵羊绦虫蚴病诊断上的应用

【目的】探讨细粒棘球蚴CE18重组蛋白作为绦虫蚴病免疫诊断抗原的应用价值,为筛选绦虫蚴病血清学诊断抗原提供依据。【方法】应用棘球蚴CE18重组抗原建立间接ELISA方法,分别对18份脑多头蚴、15份细颈囊尾蚴、19份棘球蚴感染绵羊血清及194份棘球蚴病疫区绵羊血清和13份健康羊血清进行检测,通过显著性差异分析评价CE18蛋白作为诊断抗原的意义。同时,应用生物学软件对CE18抗原蛋白同源序列进行分析,进一步从分子水平上提示CE18蛋白作为绦虫蚴病诊断抗原的依据。【结果】序列分析表明棘球蚴CE18蛋白基因为多种绦虫如泡状带绦虫、多头带绦虫、猪带绦虫等的共有序列,其蛋白质氨基酸序列相似性很高,不同种属之间高达99%,从分子水平上表明CE18蛋白为带绦虫蚴共同抗原成分之一。重组抗原CE18-ELISA方法检测绵羊血清抗体水平显示:脑多头蚴病、细颈囊尾蚴病、棘球蚴病和棘球蚴病疫区血清的阳性率分别为38.89%、73.33%、100%和76.14%,而对照组血清为阴性反应。【结论】CE18重组蛋白可作为绵羊棘球蚴病和细颈囊尾蚴病血清学诊断抗原,用于畜群活体检疫初筛试验。

青海省海西地区羊泰勒焦虫病的血清学诊断

用泰勒焦虫的重组蛋白P48作为DLISA诊断抗原,对青海省海西地区羊泰勒焦虫病进行了血清学调查。结果在651份山羊和绵羊血清中,检出抗体阳性的血清25份;阳性率分别为3.85%。表明青海省海西地区的羊群中存在羊泰勒焦虫的感染。

重组绵羊肺表面活性物质结合蛋白A的体外生物学活性检测

旨在研究重组绵羊肺表面活性物质结合蛋白A(rSP-A)对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性及淋巴细胞体外增殖的影响,初步分析rSP-A的抑菌活性。使用绵羊肺炎支原体(Mo)感染体外培养的绵羊外周血中性粒细胞以刺激其释放NE,然后应用底物显色法对比分析不同浓度rSP-A对NE活性的影响;使用MTT比色法测定rSP-A对体外培养的绵羊外周血淋巴细胞增殖活性的影响;使用酸化法和平板菌落计数法测定rSP-A对Mo代谢与增殖的影响;应用平板菌落计数法对rSP-A的抑菌活性进行初步分析。NE活性检测结果表明,rSP-A可显著增强Mo刺激绵羊外周血中性粒细胞释放的NE活性(P<0.05),且呈剂量效应关系;淋巴细胞增殖试验显示,rSP-A能够显著抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05);代谢试验证实rSP-A对体外培养的Mo的代谢具有明显的抑制作用(P<0.01);抑菌试验显示,rSP-A对致病性肺炎链球菌和巴氏杆菌的增殖具有明显的抑制作用(P<0.05)。研究结果说明,真核表达的rSP-A具有明显的生物学活性,这为进一步研究绵羊体内肺表面活性物质结合蛋白A(SP-A)的生物学特性奠定了基础。

热力学因素对绵羊重组朊蛋白体外构象转化的作用

构建了绵羊朊蛋白的原核表达载体,获得了高纯度的融合表达蛋白。并在热力学因素的作用下,研究了重组绵羊朊蛋白的构象转化。以基因型为ARQ/ARQ蒙古绵羊的血液DNA为模板,利用DNA重组技术,将绵羊朊蛋白正常成熟蛋白基因OvPrP插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL2l(DE3)中高效表达,获得的表达产物以包涵体形式存在,并对其进行纯化和复性。超滤浓缩后浓度约为0.5 mg/mL的OvPrP97-234,进行热力学处理,利用远紫外线圆二色谱(CD)分析热力学处理前、后蛋白的二级结构的变化,同时,对热力学处理前、后的蛋白进行了蛋白酶K抗性的检测,并对其高级结构进行了预测。结果表明:获得的表达产物经SDS-PAGE分析可见分子量为16kD的蛋白条带,Western-blotting的鉴定证实了所获得的蛋白是特异性的朊蛋白。经Jascow32软件分析,测得天然构象的OvPrP97-234的二级结构含量为:α螺旋为28.8%、β折叠为0%、转角和无规卷曲为71.1%,无蛋白酶K的抗性。经过热力学处理之后,OvPrP97-234的二级结构含量为:α螺旋为19.3%,β折叠为36.9%,转角和无规卷曲为43.8%,有一定的蛋白酶K抗性。绵羊重组朊蛋白的体外构象转化的分析为朊蛋白的体外构象转化机制和致病机理的研究提供科学依据。