黑莓果实UGT78H2重组蛋白诱导的响应面优化与蛋白纯化

UGT78H2是从黑莓果实中新发现的一个植物糖基转移酶家族成员,获得重组蛋白是后续深入研究该基因功能的基础。本研究通过构建原核表达载体,并应用响应面分析方法对重组蛋白的诱导条件(如诱导温度、IPTG浓度、菌液浓度和诱导时间)进行了优化,结果表明:(1)构建了p ET32a-UGT78H2原核表达载体,并成功导入到BL21(DE3)p Lys S细菌中;(2)经响应面优化,在29.5℃培养工程菌至菌液OD600=0.51,加入终浓度为0.4mmol·L-1的IPTG诱导7.4 h,可获得最大量重组蛋白166.4μg·m L-1(占总蛋白41.6%);(3)诱导时间和培养温度极显著地影响重组蛋白表达量,诱导剂IPTG和诱导前菌液浓度之间的交互效应显著影响重组蛋白的表达;(4)获得的带S-tag和His-tag的UGT78H2重组蛋白分子量为67.9 k Da,主要以包涵体形式存在,通过Ni-NTA柱纯化,成功获得了重组蛋白。以上结果为进一步采用酶学方法进行UGT78H2蛋白功能鉴定提供了基础资料。

肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-comD、E.coliBL21DE3pET42a-comE和E.coli BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。

逆转录病毒表达系统及其在外源蛋白高效表达中的应用

逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统,它由逆转录病毒载体,包膜蛋白载体和包装细胞系构成,在基因治疗和生物制药领域有很大的应用潜力。逆转录病毒和宿主细胞基因组的重组倾向于发生在转录活性区;口炎疱疹病毒-G蛋白(vesicular stomatitis virus G,VSV-G)能有效扩大逆转录病毒感染宿主细胞的范围、提高逆转录病毒的感染效率;用高滴度的重组病毒感染细胞,经过简单的筛选即可获得高表达细胞株。就逆转录病毒表达系统的组成、感染的特点和机制及其应用前景作了概述。

大肠杆菌蛋白酶系统的研究进展

基因工程菌大肠杆菌细胞中含有多种蛋白酶,具有重要的生理功能,同时也是影响外源蛋白表达水平的重要因素,大肠杆菌蛋白酶系统的研究是工程菌改良的基础。为减少蛋白酶对外源蛋白的降解,从不同的角度做了大量工作,其中利用反义RNA技术控制蛋白酶活性是一条值得探索的思路。

非小细胞肺癌bax蛋白的表达及意义

目的 :探讨凋亡相关基因bax在人非小细胞肺癌 (non smallcelllungcarcinoma ,NSCLC)组织中的表达情况及其与肺癌临床病理特征和预后的关系。方法 :用免疫组织化学SABC法检测 6 8例NSCLC中bax蛋白的表达水平 ,用TUNEL法检测其中的细胞凋亡情况。研究对象 :鳞癌 38例 ,腺癌 30例 ,同时检测 11例正常肺组织作为对照。结果bax蛋白在肺癌组织中的阳性表达率为 5 4 4 1% ,正常肺组织为 10 0 % ,两者差异有极显著性 (P <0 .0 1) ;在鳞癌中的阳性表达率为 39 4 7% ,小于腺癌的73 33% (P <0 0 1) ;bax的表达与T和N情况、临床分期、年龄、性别和是否吸烟无关。NSCLC组织的凋亡指数 (AI)为 1 79± 0 5 1,小于正常肺组织的 14 33± 5 6 2 (P <0 0 5 )。在NSCLC中 ,bax蛋白表达阴性者生存时间长于阳性者 (P <0 0 5 )。结论 :bax蛋白的表达与非小细胞肺癌的组织类型和预后相关 ,并通过对细胞凋亡的调控参与了肺癌的发生、发展。

抗人羧酸酯酶-Ⅱ多克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:构建人羧酸酯酶-Ⅱ(hCE-Ⅱ)原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体(pAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-GST)和pET-32a-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-His)。在宿主菌BL21内进行诱导表达,hCE-Ⅱ-GST融合蛋白作为免疫原免疫大耳白兔,用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用间接ELISA、West-ernblot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果:成功制备了抗hCE-Ⅱ的多克隆抗体。Westernblot鉴定表明该抗体可特异性识别重组蛋白以及天然的人肝微粒体蛋白。免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性结合肝包浆中的hCE-Ⅱ蛋白,而不与血管平滑肌细胞结合。结论:制备的pAb有较高的效价和较好的特异性,为肝癌诊断试剂盒的研究奠定了实验基础。

亨廷顿舞蹈病的IT15基因片段真核表达载体构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达定位

目的构建亨廷顿舞蹈病的致病基因IT15基因片段的真核表达载体，观察其在SH—SYSY细胞内的表达分布情况。方法以PCR方法扩增出健康人和亨廷顿舞蹈病患者的IT15基因1号外显子片段，应用基因重组技术与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合构建以GFP为报告基因的重组真核表达质粒GFP-Htt-19Q与GFP-mHtt-70Q，并经酶切分析和测序证实。利用脂质体瞬时转染人神经母细胞瘤细胞SH-SYSY细胞；Westernblot证实亨廷顿蛋白氨基末端片段在SH—SYSY细胞内表达；荧光显微镜观察正常与变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在细胞内的表达定位情况。结果健康人和亨廷顿舞蹈病患者的IT15基因1号外显子的PCR产物分别为170、310bp的特异性片段；重组体GFP-Htt-19Q与GFP-mHtt-70Q经测序分析读码框正确，转染SH-SYSY细胞后发现正常亨廷顿蛋白氨基末端片段弥散分布于胞质内，胞核内少见，而变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在核周及核内形成聚集物。结论构建IT15基因片段真核表达载体是研究亨廷顿舞蹈病的发病机制的有效方法之一；变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在核周及核内形成聚集物可能是亨廷顿舞蹈病致病的关键。

重组风雨花凝集素在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高重组表达质粒pET32c-ZGA在大肠杆菌中的表达量,对表达重组风雨花凝集素基因工程菌的培养条件进行优化筛选,对影响蛋白质表达量和工程菌生长的因素如pH值、诱导温度、IPTG、接种量、诱导时间、补充碳源形式、诱导时机、无机离子等进行了探索.经过优化,重组融合目的蛋白占菌体总蛋白的61.8%,比优化前提高了13.4%.条件优化后,pET32c-ZGA工程菌经过放大培养,获得6 g/L的湿菌体量,超声波破碎菌体,SDS-PAGE证实重组融合蛋白以包涵体形式表达.