还原型Western blot方法检测人热休克转录因子1的氧化还原构像

目的 分辨、检测人类热休克转录因子 1 (hHSF1 )的氧化还原构像 ,以了解构像的改变对其功能的影响。方法 建立了一种新型的还原型Westernblot检测法 ,使已形成稳定屏障式抗原核心 ,双硫键交联的氧化型人类热休克转录因子 1 (ox -hHSF1 )还原 ,恢复其免疫检测活性。结果 无论在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的还原型Westernblot中都可检测出一个在常规不能检测出的、移动快速、结构致密、分子内双硫键交联的ox hHSF1构像。ox hHSF1的出现 ,使hHSF1在体外不能被热诱导激活形成三体 ,失去其与DNA结合的功能。结论 还原型Westernblot的建立 。

硫氧还蛋白-1(Trx1)氧化还原状态的检测

硫氧还蛋白-1(thioredoxin-1,Trx1)是一种广泛存在于生物体内的氧化还原调节蛋白,其氧化还原状态的变化是细胞内发挥氧化还原调控作用的重要过程.本文建立了Trx1氧化还原状态的检测方法—氧化还原蛋白免疫印迹法(redox Western blot),即通过碘乙酸(IAA)标记Trx1,根据蛋白所带负电荷的不同,达到分离蛋白氧化与还原状态的目的,并根据能斯特方程计算出相应的氧化还原电势.本方法是在蛋白免疫印迹(Western blot)的基础上建立的,具有低成本、易操作的特点.实验中分别采用H2O2和DTT处理样本,利用此方法检测了细胞裂解液中、细胞内及过表达Trx1氧化还原电势的变化;并检测了HEK293细胞不同生长时期Trx1的氧化还原状态.