多纹钱蝶鱼源海豚链球菌的分离鉴定及灭活疫苗的免疫效果

为探究养殖的多纹钱蝶鱼(Selenotoca multifasciata)病害频发的原因,建立有效的病害防控方法,对暴发于海南养殖场的多纹钱蝶鱼病害开展调查并进行灭活疫苗的研制及免疫保护效果评估。分离到2株病原菌LSSM和DFSM,经形态学和16S rDNA序列分析,将病原鉴定为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。将这2株菌与实验室收集保藏的2株鱼源海豚链球菌(菌株GXTO和GXAS)进行了血清型鉴定和耐药性、致病性分析,制备了灭活疫苗并评价了疫苗的免疫保护效果。研究表明:4株海豚链球菌鉴定为血清Ⅰ型。所有菌株均对青霉素类、头孢类、四环素等23种抗生素高度敏感、对丁胺卡那耐药,其中海南株LSSM、DFSM对庆大霉素和卡那霉素抗生素耐药,广西株GXTO和GXAS对庆大霉素和卡那霉素敏感。DFSM、GXTO和LSSM对多纹钱蝶鱼的半数致死量(LD_(50))分别为7.20×10^(2)、2.72×10^(3)和3.40×10^(6) CFU/尾,GXAS未显示毒力。分别制备3株毒株(DFSM、GXTO和LSSM)的灭活疫苗,通过腹腔注射途径免疫多纹钱蝶鱼,各组免疫鱼在同源菌株攻毒后,获得的免疫保护率分别为84.6%~85.7%、69.2%~71.4%和33.3%~40.0%;此外,DFSM免疫鱼在异源毒株LSSM和GXTO攻毒后,获得的交叉免疫保护率分别为86.7%和100%。本研究确定了海豚链球菌是海南养殖的多纹钱蝶鱼病害频发的病原,使用DFSM株制备的海豚链球菌灭活疫苗对多纹钱蝶鱼有良好的免疫保护效果。

罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析

表面免疫原性蛋白(Surface Immunogenic Protein,Sip)是B群链球菌(Group B Streptococcus,GBS)的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。研究从实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达载体pColdII-Sip,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株。经诱导表达、SDS-PAGE电泳检测显示重组蛋白主要以可溶形式表达。重组蛋白用亲和层析的方法纯化,蛋白纯度达98%。纯化后的重组蛋白免疫罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)以分析其免疫原性。受免鱼免疫14d后进行人工攻毒试验,免疫组的相对保护率为70%—87%。酶联免疫吸附试验(Elisa)显示受免鱼对重组蛋白产生了较好的免疫应答,免疫剂量为3μg/g和5μg/g时受免鱼血清抗体滴度可达1:128000。研究结果显示重组蛋白Sip具有较强的免疫原性和保护作用,Sip基因可作为罗非鱼链球菌基因工程亚单位疫苗候选基因。

嗜水气单胞菌HEC毒素苗对鲫鱼的免疫效果的初步研究

用嗜水气单胞菌强毒株BSK－10和TPS－30的HEC毒素苗分别免疫鲫鱼，以不同嗜水气单胞菌菌株攻毒，测定免疫保护率。结果显示：BSK－10HEC毒素苗对同型菌株攻击保护率达90％－100％，对异型菌株攻击的保护无效，为0－20％；TPS-30HEC毒素菌对同源菌株攻击的保护率达100％，对同型菌株的保护率为75.5％-100％，对异型菌株的保护率为44.4％-100％，经统计检验，TPS－30毒素苗对10株攻毒株的保护除1株无效外，其余均效果极显著或显著，对血清型不同的菌株的免疫保护率没有区别。

微生态制剂对牙鲆非特异性免疫因子影响的研究

以牙鲆为试验材料,在基础饲料中分别添加5种不同配伍的微生态制剂,以基础饲料为对照,饲喂60 d。定期测定牙鲆血细胞吞噬活性及血清中的抗菌活力、溶菌活力、超氧化物歧化酶活力。结果表明,添加0.4%N3+E5微生态制剂对吞噬活性促进作用最为显著;添加N3微生态制剂对血清中抗菌活力和溶菌活力的促进作用尤为显著;第40天,添加了N3、E5、N3+E5和枯草芽孢杆菌组,溶菌活力分别比对照组提高了195.2%,222.7%,153.0%,113.6%;此外,几种微生态制剂对超氧化物歧化酶也有一定的促进作用。60 d后,用鳗弧菌进行攻毒试验,试验组的免疫保护率分别达到43.4%,71.6%,40%,62.2%,20%,表明所用微生态制剂可以促进牙鲆的非特异性免疫功能。

海岸带风口沙地提高木麻黄造林效果的研究

自 1 998年 5月以来 ,在福建省惠安县赤湖林场和东山县赤山林场木麻黄基干林带前沿风口干旱沙地 ,进行提高木麻黄造林效果配套技术研究。经 2年试验研究 ,在分析风口困难立地造林失败主要原因基础上 ,从木麻黄抗逆品系选择应用 ,因地制宜确定造林方式 ,采用深挖整地、放客土、拌泥浆、提早造林季节、选择大雨天冒雨造林、大苗深栽等抗旱造林配套技术以及旱季培土抚育保墒、浇水保苗和筑沙堤设风障防潮防风工程措施相结合的造林方法 ,在造林屡次失败的风口沙地木麻黄造林保存率提高到 80 %～ 90 %。在造林技术上取得了重大突破 。

大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP基因DNA疫苗的构建及其免疫效果

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因序列设计特异性引物,经PCR扩增得到MCP基因编码框1392 bp全长序列,将其定向克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒并命名为pc DNA-MCP。将pc DNA-MCP质粒转染大鲵肌肉细胞系(GS-M),间接荧光免疫染色结果显示,MCP蛋白可在GS-M细胞中表达,且转染后72 h的表达量显著高于转染后48 h;收集转染后72 h的GS-M细胞,经Western blot检测,可检测到MCP蛋白的特异性表达。将真核表达质粒pc DNA-MCP以20μg/尾的剂量经背部肌肉注射免疫健康大鲵(Andrias davidianus),分别在免疫后第1、3、5、7、14、21、28、35天随机从实验组与对照组中采样,尾静脉采血进行外周血血细胞计数、白细胞分类计数及测定血清中和抗体效价。结果表明,免疫大鲵体内红细胞、中性粒细胞和单核细胞数量明显增加,红细胞数在第5天极显著高于对照组(P<0.01);中性粒细胞(neutrophil)分类百分比从第3天开始升高,第5天达到峰值(26.33±1.04)%,极显著高于对照组(P<0.01);单核细胞(monocyte)的变化趋势和中性粒细胞相似,第7天达到峰值(15.83±0.76)%,极显著高于对照组(P<0.01)。随后淋巴细胞大量增殖,第28天淋巴细胞分类百分比达到峰值(68.33±1.53)%,极显著高于对照组(P<0.01)。血清中和试验结果表明,免疫大鲵体内产生了抗MCP蛋白的抗体,免疫后第28天抗体效价最高[1︰(370.01±31.55)]。真核质粒pc DNA-MCP在免疫大鲵的肌肉、肝、脾和肾的组织表达检测结果显示,免疫接种后第1、3、5、7、14、21、28天大鲵的肌肉、肝、脾和肾组织中均存在真核质粒的分布;RT-PCR结果显示,免疫后第7天和28天,在大鲵的上述组织中均有目的基因的表达。攻毒感染试验结果显示,免疫组大鲵相对免疫保护率可达73.3%。本研究为真核表达质粒pc DNA-MCP作为潜在候选疫苗应用于大鲵虹彩病毒病的预防和控制奠定了前期基础。

养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其疫苗研制

2006年9月山东胶南某养殖场大菱鲆(Scophthalmus maximus)发生病害,从患病大菱鲆脾脏分离出优势菌株WY28,人工感染试验证实WY28菌株对大菱鲆和斑马鱼(Danio rerio)有较强的致病性,其对大菱鲆和斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为39cfu/g(BW)(3.3×102cfu/ind)和2.1×104cfu/g(BW)(6.4×103cfu/ind)。综合该菌在形态与生理生化特征及16SrDNA同源性等方面的实验结果,确定WY28菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。该菌对先锋霉素V、庆大霉素、氟哌酸、痢特灵等抗生素敏感。WY28菌株经福尔马林灭活制成灭活疫苗,对大菱鲆进行腹腔注射免疫,免疫后第4周测得免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价平均为1∶1280。免疫后第6周,免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价达到更高水平(平均值为1∶3289.6)。攻毒试验表明,受免鱼的相对存活率明显高于对照组。由此可见,利用从病鱼体内分离的迟缓爱德华氏菌菌株制备的灭活疫苗能使大菱鲆较有效抵御迟缓爱德华氏菌强毒株的攻击。

NAA,IBA,GA_3对马铃薯扦插苗成活率的影响

研究了不同浓度萘乙酸（ＮＡＡ）、吲哚丁酸（ＩＢＡ）、赤霉素（ＧＡ３）混合使用对马铃薯脱毒苗扦插成活率的影响。结果表明，ＮＡＡ５０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ５０ｍｇ／Ｌ＋ＧＡ３３ｍｇ／Ｌ为扦插处理的最佳组合，马铃薯成活率最高，生根最好，长势最强。

溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗的构建及其免疫效果评价

为了研究溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用,本研究采用OverlapPCR和同源重组技术,构建了kdpD/kdpE(kdpDE)基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究,发现kdpDE的缺失对溶藻弧菌的生长速率和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力、生物被膜形成能力较野生株下降。斑马鱼致病性实验结果显示,突变株毒力下降78.5倍,表明减毒株构建成功,可以作为减毒活疫苗的候选菌株。突变株在鱼体内存活能力实验结果显示,注射免疫7d后,鱼体内未检测到该菌。以突变株ΔkdpDE为抗原,分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼,免疫后第28天用溶藻弧菌和哈维氏弧菌攻毒,评估该疫苗候选株及不同免疫方式对斑马鱼的保护效果。实验结果表明,免疫后的斑马鱼能够抵抗溶藻弧菌的感染,其中注射免疫组的免疫保护率达83.3%,浸泡免疫组次之(66.7%);同时,该减毒活疫苗能刺激斑马鱼对哈维氏弧菌产生交叉保护效应,其中注射免疫组的免疫保护率为65.5%,浸泡免疫组为55.2%。以上结果表明,kdpDE基因敲除突变株可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效候选减毒活疫苗。

银鲫肠道内抑制嗜水气单胞菌的潜在益生菌筛选及其特性研究

从养殖的银鲫(Carassius auratus gibelio)肠道中分离纯化得到60株具有不同特征的菌株,以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为指示菌,点种法初筛得到12株菌株,再通过牛津杯实验筛选出4株对嗜水气单胞菌有明显抑制作用(抑菌圈直径在14 mm以上)的益生菌疑似株,并进行了耐热试验、耐酸试验和人工肠液耐受试验,筛选出最符合益生菌功能特性的菌株YJ-9。该菌株在90℃高温水浴30 min后相对存活率为1.51%,在pH3的液体培养基中4 h内相对存活率为8.37%,活菌数都保持在106 CFU/mL以上,并且可以在人工模拟肠液中缓慢生长。在急性毒力实验中,10倍于实验剂量的菌株YJ-9对银鲫无毒,动物保护实验证明菌株YJ-9能有效增强银鲫对嗜水气单胞菌的免疫抵抗力,相对保护率达到80%。研究结果表明,菌株YJ-9可以作为一个新的饲用微生态制剂候选菌种。

一种复方中草药饲料添加剂在红笛鲷网箱养殖中的应用

将黄芪、当归、甘草和山楂等粉碎后按一定比例配伍制成复方中草药饲料添加剂后,按质量分数0.5%、1.0%、1.5%和2.0%添加到基础饲料中,连续投喂红笛鲷(体重234.95±19.26 g,体长24.76±1.42 cm)56 d,研究复合中草药制剂对红笛鲷生长、成活、免疫和抗病力的影响。结果表明,基础饲料中添加本复方中草药饲料添加剂能够显著促进红笛鲷的生长,增强其血清中的抗菌活力和溶菌酶活力,提高红笛鲷成活率及其对溶藻弧菌的免疫保护率,其中以添加1.5%(质量分数)和连续饲喂28 d效果为最佳(P<0.01)。

嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后大鲵外周血免疫指标的变化

以福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)作为免疫原(F-AH),通过腹腔注射免疫健康大鲵(Andrias davidianus),分别于免疫后的第1、4、7、14、21、28天采集血液样品,进行大鲵外周血液的血细胞计数与白细胞组成分析,测定吞噬细胞的吞噬活性以及血清中和抗体效价,于免疫28 d后进行攻毒感染试验。结果表明,与对照组相比,在免疫后第4、7、14和第21天,免疫大鲵外周血中血细胞数量显著增加,其中,红细胞和白细胞数量均于第4天达峰值,分别为7.83×107个/mL和6.74×106个/mL;嗜中性粒细胞百分比也在第4天达峰值,为28.60%,单核细胞百分比在第7天达峰值,为10.53%;吞噬细胞活性显著提高,且吞噬百分比和吞噬指数均在第4天达到最高值,分别为34.09%和3.73。随后,淋巴细胞百分比和中和抗体效价显著增加,均在第21天达峰值,分别为75.30%和1︰426.67。攻毒感染实验结果表明,免疫组的相对免疫保护率为69.23%。由此可见,F-AH免疫原能够通过促进血细胞数量的增加、吞噬细胞吞噬活性增强以及特异性抗体的产生等方式提高大鲵的免疫保护力。

溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护

为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护。PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达。ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体。攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致病性溶藻弧菌的感染。结果表明,质粒pcDNA-flaC可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的疫苗候选物。

贴壁培养细胞台盼蓝拒染试验的方法学探讨

本工作旨在探讨贴壁培养细胞台盼蓝拒染试验的方法,为其合理应用提出建议。用正常培养及NaN_3作致死处理的人视网膜色素上皮细胞株-19,进行原位贴壁细胞和培养体系上悬液中细胞的台盼蓝拒染实验,并比较其原位法与计数板法所测活细胞率。与计数板法相似,随染液浓度增高或染色时间延长,原位台盼蓝拒染实验的活细胞率检测值逐渐增加。培养体系上悬液中脱落细胞的存活率显著低于贴壁的细胞,NaN_3处理使脱落细胞增加。因此,对于贴壁牢固的培养细胞,原位台盼蓝染色是检测活细胞率的实用方法。根据细胞从培养表面上消化下来的难易程度和脱落到培养上悬液中的数目多少,可选用原位染色法或/和计数板法台盼蓝拒染试验,从而检测贴壁培养细胞的总存活率。

多效价载体疫苗免疫大菱鲆效果评价

采用注射与浸泡2种方法,对构建的多效价载体疫苗MVAV6203A-1进行了免疫保护效果和血清效价的研究。结果显示,用多效价载体疫苗注射免疫大菱鲆(Scophthalmus maximus),可同时获得对鳗弧菌(Vibrio anguil-larum)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫保护效果,免疫相对保护率分别为80.6%和77.0%;用ELISA方法测定血清效价的结果显示,免疫MVAV6203A-1后大菱鲆血清效价最高达到2 048,均值为891,明显高于对照组的97;用多效价载体疫苗浸泡免疫大菱鲆后,对鳗弧菌与嗜水气单胞菌的免疫相对保护率分别为62.2%和11.7%。血清效价分析显示,实验组与对照组的均值均为64。上述结果表明,所构建的疫苗MVAV6203A-1可有效提高大菱鲆对鳗弧菌和嗜水气单胞菌的免疫力,并且免疫和攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子。本研究旨在为鳗弧菌与嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病防治提供技术支撑。

草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。

庄河地区胃癌综合防治初期效果的流行病学评价

目的 从流行病学的角度分析、评价辽宁省庄河地区胃癌高发现场“九五”期间所实施的胃癌一、二级综合防治措施的初期效果。方法 跟踪随访观察干预组和对照组人群胃癌死亡的详细情况 ,计算两组人群的胃癌累积死亡率和累积减寿率 ,以及干预组相对对照组死亡和减寿的RR值和AR %值 ,并计算首次检出胃癌患者的 3年生存率 ,综合这些指标对干预试验的初期效果作出流行病学评价。结果 综合干预措施对人群胃癌死亡的RR值为 :0 5 70 6 (95 %CI:0 370 5～ 0 8789,P <0 0 5 ) ,AR %值为 42 94% ;对人群胃癌减寿率的RR值为 :0 6 5 5 0 (95 %CI:0 5 35 6～ 0 80 10 ,P <0 0 5 ) ,AR %值为 34 44 % ;检出胃癌患者的 3年生存率达 72 6 7%。结论 庄河地区实施的胃癌综合防治显著降低了试验干预人群的胃癌死亡和胃癌对人群寿命的影响 ,提高了胃癌患者的生存率 ,取得了预期的效果。

鲁氏耶尔森氏菌口服微球疫苗特性分析及免疫效果研究

为制备并评价鲁氏耶尔森氏菌口服微球疫苗的免疫效果,实验采用天然高分子聚合物海藻酸钠为疫苗载体,鲁氏耶尔森氏菌灭活疫苗为抗原,制备鲁氏耶尔森氏菌口服疫苗。以拌料口服方式进行免疫,通过血清非特异免疫指标、抗体效价、免疫保护率等综合评价疫苗的免疫效果。结果表明,鲁氏耶尔森氏菌口服微球疫苗成球性好,粒径均匀,粒径(8.76±1.73)μm,跨距0.47,包封效率94.51%,具备良好的抗酸性、肠溶性及高安全性的特点。将疫苗免疫斑点叉尾,能显著提高斑点叉尾血清中溶菌酶活力、总超氧化物歧化酶活力(T-SOD)以及补体替代途径活性(ACH_(50));血清凝集效价于第5周达到峰值为1︰8,至免疫后第8周仍能检测到特异性抗体;口服鲁氏耶尔森氏菌微球疫苗的斑点叉尾获得的抗鲁氏耶尔森氏菌相对免疫保护率为65.52%。综上所述,实验制备的鲁氏耶尔森氏菌口服微球疫苗能够对鲁氏耶尔森氏菌病起到较好的预防作用。

不同水分条件下植物生长调节剂对甘薯移栽后根系的影响

在温室内利用盆栽种植方式,研究了植物生长调节剂处理在甘薯移栽后不同水分条件下对甘薯根系的影响。结果表明,在轻度干旱胁迫下,甘薯苗期移栽成活率和根系须根数目显著下降,而根系生物量和的抗氧化酶活力变化不明显。在中度和重度干旱胁迫下,除MDA含量急剧上升外,移栽成活率、根系数目、生物量和抗氧化酶活力均显著下降。植物生长调节剂在干旱胁迫下减缓了根系移栽成活率、须根数目、生物量和抗氧化酶活力的下降。

接种不同种类病原菌脂多糖对翘嘴鳜细菌性败血症的免疫保护力比较

用柱状嗜纤维菌 (C .columnaris)、嗜水气单胞菌 (A .hydrophila)和迟缓爱德华氏菌 (E .tarda)等 3种菌中提取的脂多糖 (LPS)作为免疫原 ,分别接种翘嘴鳜后 ,通过测定受免鱼血清中凝集抗体效价、血液中白细胞的吞噬活性和A .hydrophila活菌攻毒的方法 ,比较了接种 3种LPS对翘嘴鳜细菌性败血症的免疫保护力 (RPS)。结果表明 ,与对照组相比 ,受免鱼血清中均可产生较高的凝集及交叉凝集抗体效价 ,血液中白细胞的吞噬活性极显著地升高 ,而且具有较高的交叉RPS。推测LPS对翘嘴鳜既具有特异性免疫活性 。