微小RNA-23靶向线粒体分裂蛋白1调控炎症反应和氧化应激保护脓毒症肾小管上皮细胞损伤

目的探讨微小RNA-23(microRNA-23,miR-23)和线粒体分裂蛋白1(fission protein 1,FIS1)在脓毒症肾小管上皮细胞中的作用关系以及miR-23靶向FIS1对细胞炎症反应和氧化应激的调控。方法体外培养人肾小管上皮细胞(human kidney-2,HK-2),用脂多糖(lipopolysaccha-ride,LPS)诱导建立脓毒症模型;利用双荧光素酶报告基因验证miR-23和FIS1的相互作用。将HK-2细胞采用随机数字表法随机分组,用miR-23的模拟物/抑制物和FIS1的真核表达载体/小干扰RNA单独或联合处理,细胞计数试剂检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒检测细胞MDA水平,酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)1β、IL-6和IL-10水平。结果LPS诱导的HK-2细胞miR-23 mRNA表达量为对照组的(0.60±0.12)倍(P<0.05),FIS1 mRNA表达量为对照组的(2.16±0.21)倍(P<0.05),FISI蛋白表达水平是对照组的(2.69±0.28)倍(P<0.05)。miR-23可以与FIS1的3'-UTR区形成互补结合,负向调控FIS1。miR-23 mimic组的TNF-α、IL-1、IL-6分别为(0.021±0.003)、(0.0310±0.007)和(0.017±0.006)ng/ml,FIS1 siRNA组的TNF-α、IL-1、IL-6分别为(0.015±0.004)、(0.043±0.007)和(0.020±0.008)ng/ml,均低于空白对照组(P<0.05),两组的IL-10分别为(0.325±0.011)和(0.376±0.018)ng/ml,高于空白对照组(P<0.05)。miR-23 inhibitor组的TNF-α和IL-6分别为(0.117±0.015)和(0.096±0.007)ng/ml,pcD-NA3.1-FIS1组TNF-α和IL-6分别为(0.168±0.024)和(0.147±0.030)ng/ml,均高于空白对照组(P均<0.05),miR-23 inhibitor组和pcDNA3.1-FIS1组的IL-10分别为(0.149±0.012)和(0.121±0.024)ng/ml,均低于空白对照组(P<0.05)。miR-23 mimic+pcDNA3.1-FIS1组TNF-α、IL-1、IL-6分别为(0.060±0.010)、(0.084±0.009)和(0.048±0.008)ng/ml,均高于miR-23 mimic组的(0.021±0.003)、(0.0310±0.007)和(0.017±0.006)ng/ml(P<0.05),IL-10为(0.149±0.025)ng/ml,低于miR-23 mimic组的(0.325±0.011)ng/ml(P<0.05)。miR-23 inhibitor+FIS1 siRNA组TNF-α、IL-1、IL-6分别为(0.049±0.007)、(0.056±0.008)和(0.037±0.006)ng/ml,均低于miR-23 inhibitor组的(0.117±0.015)、(0.085±0.015)和(0.096±0.007)ng/ml(P<0.05),IL-10为(0.325±0.027)ng/ml,高于miR-23 inhibitor组的(0.149±0.012)ng/ml(P<0.05)。MiR-23 mimic组和FIS1 siRNA组ROS分别为(1328±84)和(1300±70),均低于空白对照组(P<0.05),miR-23 inhibitor组和pcDNA3.1-FIS1组ROS分别为(1825±80)和(1930±105),均高于空白对照组(P<0.05)。miR-23 mimic+pcDNA3.1-FIS1组ROS为(1538±96),高于miR-23 mimic组的(1328±84)(P<0.05);miR-23 inhibitor+FIS1 siRNA组ROS为(1490±70),低于miR-23 inhibitor组的(1825±80)(P<0.05)。MiR-23 mimic组和FIS1 siRNA组MDA分别为(17.34±2.18)μmol/L和(12.05±2.47)μmol/L,均低于空白对照组(P<0.05);miR-23 inhibitor组和pcDNA3.1-FIS1组MDA分别为(52.20±7.48)μmol/L和(46.25±6.50)μmol/L,均高于空白对照组(P<0.05);miR-23 mimic+pcDNA3.1-FIS1组MDA为(35.44±3.03)μmol/L,高于miR-23 mimic组的(17.34±2.18)μmol/L(P<0.05);miR-23 inhibitor+FIS1 siRNA组MDA为(40.26±4.87)μmol/L,低于miR-23 inhibitor组的(52.20±7.48)μmol/L(P<0.05)。miR-23 mimic组和FIS1 siRNA组细胞增殖率分别为(183±14)%和(171±11)%,均高于空白对照组(P<0.05),两组凋亡率分别为(7.89±1.21)%和(11.22±2.98)%,均低于空白对照组(P<0.05);miR-23 inhibitor组和pcDNA3.1-FIS1组细胞增殖率分别为(134±10)%和(127±9)%,均低于空白对照组(P<0.05),凋亡率分别为(23.22±2.54)%和(28.15±3.12)%,均高于空白对照组(P<0.05);miR-23 mimic+pcDNA3.1-FIS1组细胞增殖率为(148±12)%,低于miR-23 mimic组的(183±14)%(P<0.05),凋亡率为(17.02±2.29)%,高于miR-23 mimic组的(7.89±1.21)%(P<0.05);miR-23 inhibitor+FIS1 siRNA组细胞增殖率为(160±8)%,高于miR-23 inhibitor组的(134±10)%(P<0.05),凋亡率为(14.27±2.00)%,低于miR-23 inhibitor组的(23.22±2.54)%(P<0.05)。结论LPS诱导的肾小管上皮细胞miR-23和FIS1异常表达与细胞的炎症反应和氧化应激过程有关。miR-23通过靶向负调控FIS1,减轻HK-2细胞的炎症反应和氧化应激水平,对脓毒症肾小管上皮细胞损伤起保护作用。

SARA在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的表达变化

目的:建立高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化模型,检测肾小管上皮细胞转分化过程中Smad锚着蛋白(Smad anchor for receptor activation,SARA)的表达变化。方法:采用Western印迹和实时定量PCR检测细胞波形蛋白(vimentin)、紧密连接蛋白(Zona occludens-1,ZO-1)、SARA蛋白及其mRNA表达水平。结果:30mmol/LD-葡萄糖刺激后,HK-2细胞vimentin蛋白及其mRNA水平呈时间依赖性升高,而ZO-1蛋白及其mRNA水平呈时间依赖性下降,此变化在高糖刺激48h时最为显著。同时,SARA蛋白及其mRNA表达水平呈时间依赖性下降。结论:高糖可诱导HK-2细胞发生转分化,SARA可能作为保护因子参与了这一过程。

急性肾功能衰竭时肾小管上皮细胞bcl-2表达的意义

目的 探讨急性肾功能衰竭 (acuterenalfailure ,ARF)中肾小管上皮细胞bcl 2表达与细胞凋亡的关系及其意义。方法 50 %甘油分别按 5ml kg、1 0ml kg注射于Wistar大鼠后肢肌肉 ,造成不同程度的ARF ,随后在 1、6、1 2、2 4、48、96小时测定肾功能 ,并以免疫组化法检测肾小管上皮细胞bcl 2表达 ,以TUNEL、FCM及瑞氏染色法检测肾小管上皮细胞的凋亡。结果 甘油注射后肾小管上皮细胞bcl 2表达上升 ,与凋亡的发生呈现出相似的剂量及时间依赖性 ,且区域相近 ,均以外髓及远端小管为主。结论 ARF中 ,肾小管上皮细胞bcl 2表达与凋亡密切相关 。

依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织胰岛素样生长因子-1表达及肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)依那普利对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达及肾小管上皮细胞转分化(EMT)的影响。方法采用UUO大鼠模型,雄性SD大鼠32只随机分为假手术组、模型组和依那普利组。依那普利组从造模前24 h开始以依那普利10 mg/(kg·d)灌胃,模型组和假手术组以等体积的生理盐水灌胃。于造模后第14天处死大鼠,取梗阻侧肾组织,苏木精-伊红染色(HE)和Masson染色观察肾组织病理改变;实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-q PCR)检测肾组织IGF-1m RNA的表达;Western blot检测肾组织IGF-1、α-血管平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。结果模型组大鼠肾间质损伤指数逐渐增加,肾间质胶原相对面积逐渐增大,IGF-1、α-SMA蛋白表达增加,IGF-1 m RNA和钙黏蛋白表达减少。经依那普利治疗后,肾间质损伤指数和肾间质胶原相对面积下降,IGF-1、α-SMA蛋白表达减少,IGF-1 m RNA和E-钙黏蛋白表达增加,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论依那普利可通过抑制肾组织IGF-1表达抑制EMT,进而防治肾间质纤维化。

长非编码RNA-p53诱导转录本通过靶向miR-1297调控高糖处理HK-2细胞的迁移和上皮间质转化

目的探讨长非编码RNA-p53诱导转录本(long intergenic non-protein coding RNAp53 induced transcript,LINC-PINT)对高糖(high glucose,HG)处理人肾小管上皮细胞HK-2迁移和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响及其分子机制。方法分别用5.5 mmol/L、30 mmol/L葡萄糖处理HK-2细胞,记为正常糖(normal glucose,NG)组、高糖(high glucose,HG)组。将HG组HK-2细胞分为HG+si-NC组、HG+si-LINC-PINT组、HG+miR-NC组、HG+miR-1297组、HG+si-LINC-PINT+anti-miR-NC组、HG+si-LINC-PINT+anti-miR-1297组。RT-qPCR检测LINC-PINT和miR-1297的表达水平,采用Transwell和Western blot检测HK-2细胞迁移和相关蛋白的表达,双荧光素酶报告实验鉴定LINC-PINT和miR-1297的靶向关系。结果与NG组比较,HG组HK-2细胞中,LINC-PINT[(1.00±0.05)比(2.87±0.19)]和miR-1297[(1.02±0.07)比(0.43±0.04)]的表达水平分别显著升高和降低,迁移细胞数[(89.37±4.56)比(212.35±13.28)]以及基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)[(0.31±0.02)比(0.79±0.07)]、Vimentin[(0.22±0.01)比(0.58±0.03)]、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth actin,α-SMA)[(0.19±0.02)比(0.53±0.05)]和纤维粘连蛋白(fibrimine,FN)[(0.12±0.01)比(0.34±0.04)]的表达水平显著升高,E-钙黏蛋白(E-cadherin)[(0.69±0.07)比(0.27±0.02)]的表达水平显著降低(P<0.05)。抑制LINC-PINT表达或过表达miR-1297显著降低迁移细胞数[(197.28±10.25)比(137.53±7.59),(216.58±13.87)比(145.29±6.82)]、MMP-2[(0.83±0.05)比(0.47±0.04),(0.78±0.05)比(0.42±0.04)]、波形蛋白[(0.62±0.05)比(0.36±0.02),(0.56±0.04)比(0.32±0.03)]、α-SMA[(0.51±0.03)比(0.28±0.02),(0.56±0.03)比(0.30±0.02)]和FN[(0.37±0.03)比(0.23±0.03),(0.36±0.03)比(0.25±0.02)]的表达水平,显著升高E-cadherin[(0.24±0.02)比(0.58±0.03),(0.23±0.02)比(0.55±0.04)]的表达水平(P<0.05)。LINC-PINT靶向调控miR-1297的表达(P<0.05)。下调miR-1297逆转了抑制LINC-PINT表达对HG处理HK-2细胞迁移和EMT的影响(P<0.05)。结论LINC-PINT通过靶向miR-1297调控HG处理HK-2细胞的迁移和EMT。

鱼胆中毒的实验病理研究

40只Wistar 大鼠随机分为3个实验组和1个对照组。实验组分别以6. 9ml/kg、4. 6ml/kg 和2. 3ml/kg 剂量灌服草鱼胆汁。每3天一次,共5次。结果表明:实验大鼠肾近曲小管上皮细胞广泛变性坏死,其AKP 酶活性明显下降;血清BUN 显著增高。提示急性鱼胆申毒在病程迁延时主要损害肾脏,其死因为急性肾功能衰竭。本实验较成功地复制出鱼胆中毒的动物模型。

低氧诱导因子在急性肾损伤中作用机制的研究进展

急性肾损伤(AKI)是由多种病因引起的肾功能快速下降,导致氮代谢(尿素和肌酐)和/或尿量减少而出现的临床综合征,是涉及到临床多学科的问题。AKI的高发病率和死亡率,目前备受临床医生关注。大量实验数据表明低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)的激活可以改善AKI。在低氧/缺血肾脏组织中,HIF在肾小管和肾小球中均有表达。随着对AKI发病机制的研究深入,发现与HIF相关的特殊蛋白、活性化学物质以及基因治疗有望成为AKI治疗的有效手段。通过对于AKI造模动物的研究,提示这些方法通过抑制炎症、氧化应激反应、减少细胞调亡与坏死以及防止肾小管上皮细胞损伤来保护肾脏。本文意在综合论述HIF在AKI中发挥潜在治疗作用的研究进展。

bcl-2高表达提高肾小管上皮细胞抗凋亡能力的研究

目的观察凋亡相关基因bcl-2高表达抑制过氧化氢诱导肾小管上皮细胞凋亡的作用。方法构建含有人bcl-2cDNA的逆转录病毒真核表达载体PLXSN，脂质体法将重组质粒转染PA317细胞，G418筛选阳性克隆，鉴定后浓缩收集病毒上清，浓缩病毒液，感染人肾小管上皮细胞株HK-2，Westernblot检测bcl-2mRNA表达。5mmol／L过氧化氢（H2O2）诱导细胞凋亡后，流式细胞仪检测细胞凋亡发生变化。结果流式细胞仪分析显示5mmol／LH2O2成功诱导肾小管上皮细胞凋亡，bcl-2逆转录病毒感染肾小管上皮细胞后，bcl-2蛋白水平呈高表达，HKbcl-2组细胞凋亡数量（12．41±3．46）较HK-2组（19．62±4．20）显著减少（P〈0．05）。而转染空载体的对照组无明显变化（19．62±4．20，P〈0．05）。结论bcl-2蛋白高表达显著抑制氧化剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡。

一水草酸钙晶体对肾小管上皮细胞毒性作用的体外研究

目的:研究一水草酸钙(COM)晶体对肾小管上皮细胞的毒性作用。方法:以永生化的肾小管上皮HK-2细胞作为研究对象,用不同浓度的COM处理细胞,再以DAPI染色并细胞计数研究COM对HK-2细胞增殖的作用;检测细胞培养上清中的LDH含量,说明COM对HK-2的毒性;应用MTS法绘制HK-2细胞增殖曲线;使用流式细胞术检测COM对HK-2细胞的凋亡和坏死的作用。结果:DAPI染色后并细胞计数后HK-2细胞增殖能力经0.1mmol/L的COM处理后便受到抑制,并与对照组比较,差异有显著统计学意义,并随COM浓度的升高,抑制作用更加显著。1mmol/L的COM可使HK-2上清中的LDH显著升高,并在5mmol/L更加明显。1mmol/L的COM处理HK-2细胞后,细胞增殖曲线显著低于对照组,5mmol/L的COM在处理HK-2细胞的第6天几乎全部死亡。0.1mmol/L的COM可使HK-2细胞凋亡显著增加,1mmol/L的COM可使HK-2细胞坏死显著增加,并随浓度的升高而增加。结论:0.1mmol/L的COM刺激HK-2细胞即可使细胞出现生长抑制,浓度达到1mmol/L后,则可出现细胞死亡。

急性肾损伤发病与修复的机制

急性肾损伤(AKI)的组织损伤与修复过程由复杂的多种机制、多种效应细胞共同参与。肾小管上皮、微血管内皮和炎症细胞是这一复杂体系的三个关键环节。肾小管上皮细胞是急性损伤的主要靶细胞,通过分泌多种细胞因子调控免疫炎症反应,其增殖障碍直接导致纤维化的发生与发展;微血管内皮损伤后不仅参与炎症反应的发生和发展,其修复不良还导致组织持续缺血缺氧,促进纤维化的发生;AKI后持续免疫炎症反应的失调特别是单核巨噬的持续活化亦为AKI后修复不良的重要因素。

Prohibitin基因转染对肾小管上皮细胞表型转化的影响

目的探讨转染外源性Prohibitin(PHB)基因对体外培养的肾小管上皮细胞株(NRK-52E)表型转化的影响。方法将构建的pcDNA3.1(+)-PHB1、pcDNA3.1(+)-PHB2质粒转染体外培养的NRK-52E细胞作为转染组,以空载体转染NRK-52E细胞为阴性对照组,以正常NRK-52E细胞为空白对照组,分别应用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染24 h、48 h、72 h各组NRK-52E细胞PHB1、PHB2及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达。结果 1.转染24 h、48 h、72 h时转染组NRK-52E细胞的PHB1、PHB2 mRNA及其蛋白表达均较阴性对照组和空白对照组增高(Pa<0.05),且48 h表达量最高,而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。2.转染24 h、48 h、72 h时转染组NRK-52E细胞α-SMA mRNA和蛋白表达均较阴性对照组和空白对照组降低(Pa<0.05),48 h表达量最低,阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。3.转染组48 h NRK-52E细胞PHB1、PHB2蛋白表达量与α-SMA蛋白表达量均呈负相关(r=-0.942、-0.869,Pa<0.05)。结论转染外源性PHB基因可以抑制体外培养的NRK-52E细胞的表型转化。

萝卜硫素介导的内质网应激对尿酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨萝卜硫素对肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响及其对内质网应激IRE-1/JNK信号通路活化的作用。方法体外采用尿酸(200 mg/L)诱导HK-2细胞损伤模型,将细胞分为对照组、尿酸组(200 mg/L尿酸干预HK-2细胞24 h)、低剂量萝卜硫素组(200 mg/L尿酸和10μM萝卜硫素共同干预HK-2细胞24 h)、中剂量萝卜硫素组(200 mg/L尿酸和20μM萝卜硫素共同干预HK-2细胞24 h)和高剂量萝卜硫素组(200 mg/L尿酸和40μM萝卜硫素共同干预HK-2细胞24 h)。CCK8法分析了HK-2细胞增殖活性,流式细胞术检测了HK-2细胞凋亡率,Western blot分析了Cleaved caspase 3、Cleaved caspase 12、BiP/GRP78、IRE-1和JNK蛋白表达水平。结果与对照组比较,尿酸组HK-2细胞相对存活率明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05),Cleaved caspase 3、Cleaved caspase 12、BiP/GRP78、IRE-1和JNK蛋白表达明显升高(P<0.05)。与尿酸组比较,不同浓度萝卜硫素组HK-2细胞相对存活率明显增高(P<0.05),细胞凋亡率明显降低(P<0.05),Cleaved caspase 3、Cleaved caspase 12、BiP/GRP78、IRE-1和JNK表达明显下调(P<0.05)。结论萝卜硫素通过抑制内质网应激IRE-1/JNK信号通路活化,降低肾小管上皮细胞的凋亡。