Experimental study of human umbilica cord blood stromal cells transfected with recombinant adenoviral vector co-expressing VCAM-1

This work was funded from National Natural Science Foun-dation of China(No.39770335 and No.30070327)andChongqing Medical Key construction Foundation.Abstract:Ob-jective To establish the experimental foundation for furtherstudying the effect of VCAM-1 gene modified HUCBSCs

人骨形态发生蛋白_2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的 :研究人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad BMP 2 )转染人骨髓基质干细胞 (hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法 :利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP 2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果 :转染后 ,hBMP 2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP 2蛋白阳性表达 ,S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论 :Ad BMP 2可高效转染hBMSC ,且促进细胞增殖和成骨转化。

脂质体DC-Chol/DOPE对HEK293FT细胞的高效转染及其在腺病毒制备中的应用

重组病毒载体系统因为具有高效的基因转移能力得到了广泛应用,而病毒包装细胞的转染是重组病毒制备过程中的关键步骤。优化了脂质体DC-Chol/DOPE介导的转染常用的病毒包装细胞系HEK293FT的实验条件,比较了DC-Chol/DOPE、Lipofectamine2000和磷酸钙共沉淀法转染细胞的效率,并且比较了用DC-Chol/DOPE和磷酸钙共沉淀法转染293FT细胞制备重组腺病毒的结果,发现DC-Chol/DOPE对293FT细胞的转染效率以及最终收获的病毒滴度都远高于磷酸钙共沉淀法转染。所以,利用DC-Chol/DOPE转染293FT细胞制备重组病毒是一种简单、高效、成本低廉的方法。

负载肝素酶复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/ml。电镜证实病毒浓缩液中存在病毒颗粒,并可见病毒在HEK293细胞中复制。PCR双引物鉴定Adhpa可扩增出Ad及hpa特异片段,而对照则不能扩增出hpa片段。结论成功包装了负盘。

人骨形成蛋白2腺病毒表达载体转染体外培养兔腰椎间盘细胞的研究

目的研究人骨形成蛋白2腺病毒表达载体(adenovirus-mediatedhumanbonemorphogeneticprotein2gene,Ad-hBMP-2)转染体外培养兔腰椎间盘细胞,分析其对腰椎间盘细胞的影响。方法成年健康新西兰大白兔4只,体重4～5kg,取L2、L3到L6、L7节段椎间盘细胞体外培养。利用免疫荧光和蛋白印迹法(Westernblot)检测空白对照组(未转染)、Ad-LacZ组[感染复数(multiplicityofinfection,MOI)150MOI]和不同剂量Ad-hBMP-2(50、100、150MOI)组转染后细胞hBMP-2的表达水平。采用RT-PCR检测转染后细胞型胶原和aggrecanmRNA表达水平。结果转染Ad-hBMP-2后通过免疫荧光和蛋白印迹法可见随转染剂量增加hBMP-2表达量逐渐增加,与50MOI组比较100MOI组升高102%,150MOI组升高183%。在转染后第6天RT-PCR结果显示转染组aggrecan和型胶原mRNA的表达高于对照组,并且随转染剂量增高mRNA的表达量均逐渐增加。aggrecanmRNA从50MOI组的61.7%增加到150MOI组的167.3%。型胶原mRNA从50MOI组的77.3%增加到150MOI组的169.0%。结论Ad-hBMP-2可高效转染体外培养兔腰椎间盘细胞,随转染剂量增加hBMP-2表达量逐渐增加,同时上调aggrecan和型胶原mRNA的表达,并存在剂量依赖关系。

包裹E1A基因的纳米粒子制备及转染人肺腺癌细胞A549实验研究

目的制备包裹E1A基因(腺病毒早期表达基因)的纳米粒子,并观察其介导E1A基因转染人肺腺癌细胞A549的可行性和效率。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人肺腺癌细胞A549,并以阳离子脂质体为对照,用PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A基因DNA整合和mRNA表达。结果制备的纳米粒子粒径为150～280nm,包埋率为0.78%,体外释放约为22d;在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数较脂质体组多(P<0.05);PCR、RT-PCR结果表明纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因整合和mRNA表达。结论成功制备了纳米粒子,纳米粒子可携带外源基因进行基因转染。

人骨形态发生蛋白2重组腺病毒载体的构建及其生物学活性检测

目的构建人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)重组腺病毒载体(Ad-hBMP-2),并检测其转染后的骨髓基质细胞hBMP-2表达以及成骨能力的改变。方法采用Cre-lox重组方法构建含有hBMP-2基因的复制缺陷型重组腺病毒,并利用原位杂交和免疫组化手段观察转染后的骨髓基质细胞hBMP-2mRNA和蛋白表达情况;通过Ⅰ型胶原原位杂交、碱性磷酸酶测定、透射电镜观察以及裸鼠肌袋试验评价Ad-hBMP-2转染对兔骨髓基质细胞成骨能力的影响。结果病毒培养上清液的聚合酶链式反应证实构建的重组腺病毒含有Ad-hBMP-2基因,重组腺病毒滴度达3·8×1010pfu/L;感染增殖率为100的Ad-hBMP-2转染兔骨髓基质细胞24h和48h后即可分别检测到显著的hBMP-2mRNA和蛋白表达,转染效率几乎达100%;Ad-hBMP-2转染可以明显刺激兔骨髓基质细胞Ⅰ型胶原mRNA表达、碱性磷酸酶分泌、细胞内蛋白质合成以及异位骨形成等。结论Ad-hBMP-2具有高效转染能力,并能够诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化,进而促进骨形成。

Ad-hBMP-2转染体外培养人退变腰椎间盘细胞的研究

[目的]研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-hBMP-2)转染体外培养人退变腰椎间盘细胞,分析其对腰椎间盘细胞影响。[方法]成人退变腰椎间盘细胞体外培养,通过免疫组化和染色体分析鉴定椎间盘细胞。利用免疫荧光和蛋白印迹法检测不同转染剂量对细胞BMP-2表达的影响。[结果]体外培养成人退变腰椎间盘细胞第2代鉴定具有其结构功能。转染后通过免疫荧光和蛋白印迹法可见随转染剂量增加BMP-2表达量逐渐增加。[结论]Ad-hBMP-2可高效转染体外培养人退变椎间盘细胞,同时随转染剂量增加BMP-2表达量逐渐增加。

重组腺病毒载体介导HOSM基因对肝癌细胞体外增殖的抑制作用

目的:构建含人抑瘤素M(human oncostatin M,HOSM)基因的复制缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,观察其对人肝癌细胞株HepG2在体外生长抑制情况.方法:通过同源重组方法构建含HOSM基因的缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,用报告基因AD-GFP检测腺病毒的对人肝癌细胞系的转染效率;人肝癌细胞株HepG2转染含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD-HOSM后,用RT-PCR法检测外源HOSM基因在其中的表达;台盼蓝染色、细胞计数法检测AD-HOSM对HepG2的体外增殖抑制情况.结果:成功构建了重组腺病毒载体AD-HOSM,AD-HOSM对肝癌细胞HepG2有较高的转染效率,并且转染效率与病毒的剂量呈正相关.AD-HOSM感染HepG2细胞48h,HOSM基因在转染细胞能有效的表达.体外试验示,AD-HOSM转染的细胞的增殖却受到明显的抑制.结论:重组腺病毒介导HOSM表达能有效抑制HepG2在体外的增殖,提示重组腺病毒介导的HOSM基因治疗可能成为肝癌治疗的候选方案.

病毒介导的基因转染在组织工程中的应用

目的 构建重组病毒载体,将较多细胞因子通过病毒载体转入种子细胞,提高细胞增殖及分泌基质能力,维持表型,延缓老化。方法 应用基因工程技术,构建缺陷型逆转录病毒重组载体和缺陷性腺病毒重组载体。分别通过PT67包装细胞筛选克隆及293细胞扩增,获得假病毒上清液,经浓缩纯化后转染靶细胞。结果 成功构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Fas配体(Fas-Ligand)、绿色荧光蛋白(GFP)等逆转录病毒载体以及TGFβ1、人骨形成蛋白因子-7(hBMP7)、端粒酶、Smad3、Smad7等腺病毒载体,其中GFP-逆转录病毒重组载体在软骨细胞表达至2月。结论 通过有效的含目的基因重组载体转染种子细胞,延缓体外培养细胞的老化及促进细胞的增殖与基质分泌,获得组织工程所需要的大量种子细胞,为组织工程构建奠定了基础。

人GM-CSF基因转染小鼠肝癌细胞及其致瘤性研究

为建立以腺病毒为载体的GM－CSF基因转染瘤苗，并研究其体内抗肿瘤作用，应用携带有人GM－CSF基因的重组腺病毒（R－Ad5）载体转染BALB／c小鼠肝癌细胞株（H22），体外应用酶联免疫吸附试验（ELISA法）．检测GM－CSF表达水平，以GM—CSF基因转染的H22细胞进行致癌性研究。结果：（1）重组腺病毒载体能成功地介导GM－CSF基因转染H22细胞并能持续有效表达26～31天，瘤苗的辐照处理并不明显影响GM－CSF表达水平。（2）GM－CSF基因转染瘤苗体内致癌性显著降低。该结果揭示了应用GM－CSF基因转来瘤苗进行肿瘤基因治疗的可行性，为进一步研究肿瘤的GM－CSF基因治疗提供了依据．

腺病毒载体转染人大隐静脉平滑肌细胞效率的研究

目的 探讨提高静脉壁通透性对腺病毒为载体向人大隐静脉平滑肌细胞转外源基因效率的影响。方法 人体大隐静脉经机械拉伸、腔内加压灌注携 β 半乳糖酶基因的腺病毒溶液。器官培养 0、2d后 ,进行免疫组织化学染色和扫描电镜观察。研究机械因素对静脉组织形态的改变、鉴定转基因靶细胞成份、比较各组平滑肌细胞的转染率。 14d时 ,进行核增殖抗原免疫组织化学和弹力纤维染色 ,比较各组平滑肌细胞增殖指数和内膜增生程度 ,观察机械因素对培养静脉的远期影响。结果 机械牵拉和加压灌注后 ,静脉形态结构完整 ,内皮未受损伤 ,细胞间出现微小孔隙。中膜平滑肌细胞的转染率达到 ( 2 1.1± 3 .8) %。对照组静脉内皮细胞间无间隙 ,仅 ( 0 .8± 0 .2 ) %中膜平滑肌细胞表达 β 半乳糖酶。培养 14d后平滑肌细胞增生指数和内膜增生程度在各组间差别无显著性。结论 提高静脉通透性可提高腺病毒载体对中膜平滑肌细胞的转基因效率。

腺病毒介导的人骨形成蛋白7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化作用的研究

目的探讨腺病毒介导的人骨形成蛋白7(Ad-hBMP-7)转染对体外培养的人牙髓细胞增殖及向成牙本质细胞分化的作用。方法人胚肾293细胞扩增复制缺陷型重组腺病毒,选用细胞半数感染剂量法测定病毒滴度。体外培养人牙髓细胞,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测病毒的转染率。将 Ad-hBMP-7感染人牙髓细胞,Western blot 检测蛋白表达情况,噻唑蓝比色法(MTT)、酶动力学法、von Kossa 染色及半定量逆转录聚合酶链分别检测转基因细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙化结节的形成和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA 的表达。结果病毒滴度为1.785×10^(12)pfu/L;人牙髓细胞受 Ad-hBMP-7感染48 h 后即可检测到外源蛋白表达;当感染复数为75时,重组腺病毒对牙髓细胞的转染率达(91.1±1.0)%;与空载体组及未转染细胞组相比,细胞的增殖特性无明显改变;ALP 活性高于对照组(P<0.05);能够形成矿化结节;DSPP mRNA 的表达呈剂量和时间依赖性。结论 Ad-hBMP-7可促进体外培养的人牙髓细胞向成牙本质细胞分化,但对细胞的增殖无明显改变。

纳米粒子介导E1A基因体外转染人甲状腺未分化癌细胞HTC／3

目的探讨纳米粒子介导E1A基因转染人甲状腺未分化癌细胞HTC/3的可行性和效率,并检测转染细胞对X线的敏感性和X线诱导转染细胞凋亡。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人甲状腺未分化癌细胞HTC/3,并以阳离子脂质体为对照,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PER)方法检测转染细胞(HTC/3-E1A)的E1A基因mRNA表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HTC/3-E1A细胞、对照细胞的体外生长率和不同剂量X射线对HTC/3-E1A细胞的生长抑制率。HTC/3-E1A细胞经一定剂量X线(2 Gy)照射后,用流式细胞仪进行细胞周期分析,DNA电泳观察细胞凋亡。结果制备的纳米粒子直径为150-280 nm,包埋率为0.78%,体外释放约为18 d。在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数多于脂质体组(P<0.05)。RT-PCR结果表明,纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因mRNA表达。HTC/3-E1A细胞群体生长缓慢,倍增时间延长(是亲本细胞的1.44倍)。HTC/3-E1A细胞对X线敏感性较转染空载体细胞(HTC/3-Vect)和HTC/3细胞分别提高约2.9倍和2.8倍。流式细胞仪分析显示,HTC/3-E1A细胞亚G0/G1期比例显著高于HTC/3-Vect和HTC/3细胞(P均<0.01),S期比例显著低于HTC/3-Vect细胞和HTC/3细胞(P均<0.01)。DNA电泳显示,HTC/3-E1A细胞出现典型的凋亡梯度变化,而HTC/3-Vect和HTC/3细胞无此变化。结论纳米粒子可携带外源基因进行基因转染并获得表达,转E1A基因HTC/3细胞对X线敏感性明显提高,且X线诱导了转E1A基因HTC/3细胞凋亡。

腺病毒载体介导的H9C2心肌细胞外源基因表达系统的构建

本研究旨在探讨不同剂量的脂质体与腺病毒载体对转染H9C2细胞的效率的影响。应用常规剂量脂质体与减半剂量脂质体介导梯度剂量腺病毒载体转染H9C2细胞,并通过观察报告基因GFP表达计算各转染条件下的转染效率。结果发现应用常规剂量减半的脂质体反而能获得更高的转染效率;腺病毒载体与转染效率具有明显的量效关系,但是当载体量过大时转染效率有所下降。因此脂质体与腺病毒载体都具有一定的细胞毒性,细胞处于良好的状态可能更有利于外源基因的转入。