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A novel package system based on an EBV replicon vector for producing high titer recombinant adeno-associated virus vector
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作者 Yan, ZY Yao, EM +2 位作者 Zhang, T Shu, YL Hou, YD 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 1997年第20期1741-1744,共4页
ADENO-ASSOCIATED virus (AAV) was a human parvovirus considered as a gene delivery vehiclefor human gene therapy. Recombinant AAV vector (rAAV) could mediate the foreign DNAintegration into chromosome and establish a s... ADENO-ASSOCIATED virus (AAV) was a human parvovirus considered as a gene delivery vehiclefor human gene therapy. Recombinant AAV vector (rAAV) could mediate the foreign DNAintegration into chromosome and establish a stable expression in the infected cells. As a viraltransduction vector, rAAV was superior to the traditional retrovirus vector for its high safety.no pathogenicity, and capacity of infecting postmitosis cells. The current strategy for produc- 展开更多
关键词 RECOMBINANT AAV vector EBV replicon vector PACKAGE cell line.
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Construction and Characterization of a Hepatitis B Virus Replicon 被引量:5
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作者 Yin-ping LU Bao-ju WANG +4 位作者 Ji-hua DONG Zhao LIU Shi-he GUAN Meng-ji LU Dong-liang YANG 《中国病毒学》 CSCD 2007年第1期8-13,共6页
建立复制细胞肝炎 B 病毒(HBV ) 当模特儿并且在抗病毒的药评估决定它的应用程序,我们构造了表情包含了 HBV 染色体的 1.3 个拷贝,并且在 Huh7 房间在短暂 transfection 以后测量了病毒的复制的水平的 plasmid。我们然后观察了抗病毒... 建立复制细胞肝炎 B 病毒(HBV ) 当模特儿并且在抗病毒的药评估决定它的应用程序,我们构造了表情包含了 HBV 染色体的 1.3 个拷贝,并且在 Huh7 房间在短暂 transfection 以后测量了病毒的复制的水平的 plasmid。我们然后观察了抗病毒的药管理的效果。HBV (ayw ) 基因碎片的 1.3 褶层被 PCR 和限制 endonuclease 消化克隆进 pCR2.1。recombinant plasmid 是进 Huh7 房间, HBsAg, HBeAg 和 HBV 的短暂 transfected 在 Huh7 房间的上层清液的 DNA 被 ELISA 和即时 PCR 分别地测量;细胞内部的 HBV replicative 中介和细胞内部的 HBV 抄本被南部的污点和北污点分别地检测。adefovir 的抗病毒的效果,新奇 anti-HBV 核苷酸类似物,在这个细胞的模型系统被评估。结果显示 HBV replicon 的 recombinant plasmid 成功地被构造;在 plasmid pHBV1.3 带的 HBV 染色体能高效地复制并且被表示在哈 7 个房间, adefovir 能在这个细胞的模型,和抑制禁止 HBV 复制是剂量依赖者。结论是 HBV replicon,能在 hepatoma 房间高效地开始病毒的复制,可以是在 HBV 复制和抗病毒的药的学习的一个有用工具。关键词肝炎 B 病毒 - 传染 replicon - 表示向量 CLC 数字 R373 基础条款:国家自然科学基础(No.30271170, No.30170889 ) 。 展开更多
关键词 Hepatitis B virus Infectious replicon Expression vector
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日本脑炎病毒(JEV)复制子表达载体的构建及其鉴定 被引量:6
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作者 黄莺 邵炜 +2 位作者 贾丽丽 俞炜源 俞永新 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期33-38,共6页
在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检... 在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检测该载体的自主复制能力和蛋白表达情况,结果证实该载体在BHK-21细胞中能够自主复制并且表达非结构蛋白。进一步在该载体中插入报告基因EGFP,检测外源蛋白的表达情况,结果显示在转染复制子载体的24h后,荧光显微镜下能够看见绿色荧光蛋白的表达,阳性信号持续增强,能够维持10d左右,证实了构建的复制子载体pCTCJEV能够有效地表达外源蛋白,这为进一步建立以乙脑病毒复制子为基础的疫苗载体系统打下基础。 展开更多
关键词 日本脑炎病毒 复制子载体 外源蛋白
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猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析 被引量:4
4
作者 王晓杜 赵凡凡 +4 位作者 代兵 邵东华 蒋春英 周圻 马志永 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期111-118,共8页
猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编... 猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编码区序列,插入FMDV2A和丁肝病毒核酶序列构建复制子表达载体pAC-JEV,实时定量PCR、间接免疫荧光、Western blotting方法检测JEV自身蛋白(NS3)表达,验证复制子的自主复制能力。在pAC-JEV的结构蛋白C基因下游插入EGFP基因、猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的GP5基因构建重组复制子pAC-JEV-EGFP、pAC-JEV-HA、pAC-JEV-GP5和NS5基因缺失载体pAC-JEV-ΔNS5,该复制子载体转染BHK-21,荧光显微镜直接观察EGFP表达,Western blotting方法检测外源蛋白质(GFP、GP5、HA)表达情况。结果表明:随着转染时间延长,复制子转染细胞内NS3的表达逐渐增加,表明所构建的JEV复制子表达载体具有自主复制能力。EGFP mRNA转录水平和EGFP蛋白质荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续8d以上,携带猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因的复制子载体转染BHK-21细胞后,HA和GP5能有效表达,说明复制子具有表达外源蛋白质的能力。该复制子表达载体的成功构建,为深入研究JEV各蛋白质的功能、各蛋白质与细胞内蛋白质相互作用关系以及基于复制子载体的疫苗开发等提供了技术平台。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 复制子 表达载体 HA GP5
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基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗的免疫效力评价 被引量:4
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作者 李娜 赵建军 +4 位作者 赵和平 孙元 朱庆虎 童光志 仇华吉 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期434-439,共6页
此前已构建了基于SemlikiForest病毒(SemlikiForestvirus,SFV)复制子载体的表达猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)E2基因的新型猪瘟DNA疫苗pFV1CS-E2,通过动物试验证实,该疫苗以600μg/头的剂量免疫3次,免疫猪能抵抗致死剂量猪... 此前已构建了基于SemlikiForest病毒(SemlikiForestvirus,SFV)复制子载体的表达猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)E2基因的新型猪瘟DNA疫苗pFV1CS-E2,通过动物试验证实,该疫苗以600μg/头的剂量免疫3次,免疫猪能抵抗致死剂量猪瘟强毒的攻击。为进一步评价该疫苗在较低的免疫剂量和较少的免疫次数情况下的免疫效力,将DNA疫苗pSFV1CS-E2和空载体pSFV1CS按100μg/头的剂量,接种猪只2次,然后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,pSFV1CS-E2免疫组(n=5)所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了短期体温升高外,未出现任何其它临床症状,部分猪出现短期轻微病毒血症,个别猪的部分脏器出现轻微病变;而空载体免疫组(n=3)猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全都出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,有2头猪分别于攻毒后第10和11d死亡,剖检时可见典型猪瘟病理变化。结果表明,基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗有望成为具有开发价值的猪瘟标记疫苗。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 甲病毒复制子载体 DNA疫苗
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基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建 被引量:7
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作者 余云舟 孙志伟 俞炜源 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期713-718,共6页
以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFVhelper2为骨架,用CMVIE和T7启动子替换SP6启动子并在3′UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该... 以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFVhelper2为骨架,用CMVIE和T7启动子替换SP6启动子并在3′UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。 展开更多
关键词 semliki森林病毒 RNA复制子 双功能复制子载体
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XJ-160病毒复制子型表达载体的构建 被引量:6
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作者 杨益良 梁国栋 +3 位作者 付士红 苏乃伦 邓娟 侯云德 《中国病毒学》 CSCD 2003年第3期221-226,共6页
XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRe... XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。 展开更多
关键词 XJ-160病毒 复制子型表达载体 构建 辛德毕斯病毒
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一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体 被引量:4
8
作者 仇华吉 罗玉子 +1 位作者 李娜 童光志 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2004年第5期69-72,共4页
RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建... RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。 展开更多
关键词 塞姆利基森林病毒 RNA复制子 DNA 表达载体 基因疫苗
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基于SemlikiForest病毒RNA复制子的猪瘟RNA疫苗的初步研究 被引量:11
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作者 李娜 仇华吉 +4 位作者 李国新 朱庆虎 罗玉子 贾洪林 童光志 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期53-58,共6页
将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测... 将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测显示,CSFV E2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验结果表明,10μg或100μg pSFV1CS-E2可诱导小鼠产生猪瘟特异性抗体。 展开更多
关键词 Semliki Forest病毒 RNA复制子 猪瘟 RNA疫苗 猪瘟病毒 真核表达载体
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马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价 被引量:1
10
作者 仇铮 郭巍 +3 位作者 孙元 戚亭 仇华吉 相文华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期568-572,共5页
为评价马流感病毒(EIV)HA基因核酸免疫效果,本研究以甲病毒复制子载体pSFV1CS分别构建了表达EIV H3N8亚型的美洲型和欧洲型HA基因的重组真核表达质粒。并将其转染293T细胞,经间接免疫荧光鉴定表明HA基因获得表达;以重组质粒免疫的BALB/... 为评价马流感病毒(EIV)HA基因核酸免疫效果,本研究以甲病毒复制子载体pSFV1CS分别构建了表达EIV H3N8亚型的美洲型和欧洲型HA基因的重组真核表达质粒。并将其转染293T细胞,经间接免疫荧光鉴定表明HA基因获得表达;以重组质粒免疫的BALB/c鼠能够检测到特异性抗体产生,而且HI抗体水平持续升高,同时小鼠体内IFN-γ、IL-4分泌水平也有所升高。攻毒后小鼠表现轻度临床症状,但病毒分离和RT-PCR均未检测到病毒。上述结果表明,该重组质粒pSFV1CS-EIV-HA具有良好的免疫原性并且可以诱导免疫动物产生较高免疫应答的能力。 展开更多
关键词 马流感病毒 甲病毒复制子载体
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核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达 被引量:1
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作者 梅文瀚 吴兆平 +2 位作者 徐荣婷 钱关祥 卢健 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期1233-1238,共6页
目的建立一个非病毒介导外源基因高效转移和稳定表达体系。方法采用EB病毒(EBV)来源的附着体质粒载体,并结合顺式作用元件IFN-MAR构建重组质粒pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR。采用荧光显微镜观察并摄片,FACS及逆转录-聚合酶... 目的建立一个非病毒介导外源基因高效转移和稳定表达体系。方法采用EB病毒(EBV)来源的附着体质粒载体,并结合顺式作用元件IFN-MAR构建重组质粒pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR。采用荧光显微镜观察并摄片,FACS及逆转录-聚合酶链反应检测EGFP表达阳性的COS-7细胞比例、荧光表达强度及EGFP基因的转录。通过Southern印迹和质粒还原实验分析质粒DNA在细胞中存在的形式。结果本实验构建的重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR在转染进入COS-7细胞后以染色体外附着体的形式存在。由于EBVR的存在,可以在体外获得EGFP较长时间的稳定表达。IFN-MAR替代O riP后,仍可在体外获得EGFP的稳定表达。结论MAR修饰的EBV附着体载体可以在体外获得外源基因高效稳定的表达。 展开更多
关键词 基因治疗 EB病毒 复制子 附着体质粒载体 核基质结合区
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腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体的构建 被引量:1
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作者 李红梅 孙元 +4 位作者 亓文宝 孟其麟 田大勇 廖明 仇华吉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期804-808,共5页
为解决日本脑炎病毒(JEV)复制子DNA疫苗载体不稳定和递送效率低的缺点,本研究利用具有高效递送效率的人5型复制缺陷性腺病毒(AdV)来递送JEV复制子,构建嵌合载体。本研究将已构建的含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的JEV复制子克隆至经... 为解决日本脑炎病毒(JEV)复制子DNA疫苗载体不稳定和递送效率低的缺点,本研究利用具有高效递送效率的人5型复制缺陷性腺病毒(AdV)来递送JEV复制子,构建嵌合载体。本研究将已构建的含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的JEV复制子克隆至经过改造的带有SwaⅠ酶切位点的pShuttle-CMV载体中,再将来自pCI载体的嵌合内含子插入JEV复制子中,得到转移载体pSh-JEV-In-EGFP,经SwaⅠ线性化后电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态细胞,将所得重组腺粒经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,传代直至出现细胞病变,得到含有表达EGFP的JEV复制子的重组腺病毒,命名为rAdV-JEV-In-EGFP。结果表明,pSh-JEV-In-EGFP在细菌中传20代仍然保持稳定,而且在rAdV-JEV-In-EGFP感染的HEK293细胞中,JEV复制子能够自我复制,并启动EGFP蛋白稳定、高效地表达。本研究为进一步研发以腺病毒递送的JEV复制子为基础的二价新型疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 日本脑炎病毒复制子 腺病毒 内含子 嵌合载体
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猪2型圆环病毒ORF2基因在塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的新型真核表达载体中的表达 被引量:1
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作者 罗玉子 仇华吉 +4 位作者 刘建华 韩凌霞 李娜 张守发 童光志 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期948-952,共5页
猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应... 猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应用PCR方法从该毒株感染的PK 15细胞中扩增出完整的ORF2基因 ,将此基因克隆于本实验室此前构建的塞姆利基森林病毒 (SemlikiForestvirus,SFV)RNA复制子衍生的新型真核表达载体pSFV1CS中的BamHⅠ位点 ,获得重组质粒pSFV1CS Cap。用pSFV1CS Cap分别转染BHK 2 1细胞和 2 93T细胞 ,经间接免疫荧光试验检测表明 ,PCV2ORF2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验表明 。 展开更多
关键词 断乳仔猪多系统衰竭综合征 猪2型圆环病毒 塞姆利基森林病毒 RNA复制子
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基于西门利克森林病毒复制子的“自杀性”DNA疫苗载体的构建及其体外表达特性 被引量:3
14
作者 方六荣 肖少波 +3 位作者 谢京国 潘永飞 姚林 陈焕春 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期217-221,共5页
对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSFV1进行改造,即在SFV非结构蛋白(nSPs) 上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子序列(hCMV IE Pro/Enh),同时在pS- FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号... 对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSFV1进行改造,即在SFV非结构蛋白(nSPs) 上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子序列(hCMV IE Pro/Enh),同时在pS- FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号序列,获得可以完全在DNA水平上操作并具有自主复制功能的表达载体pSFV-DNA。为了进一步探讨改造载体的转染效率、表达能力以及是否能诱导细胞凋亡等特性, 将报告基因EGFP插入pSFV-DNA中亚基因组启动子下游,构建的重组表达质粒pSFV-EGFP转染BHK-21 细胞,转染后12 h即可观察到荧光,但转染效率明显低于直接由hCMV IE Pro/Enh驱动的EGFP真核表达质粒pEGFP-C1;提取转染后48 h的细胞基因组DNA,电泳发现pSFV-EGFP转染细胞均呈典型的DNA断裂(ladder),而pEGFP-C1转染细胞未观察到这种现象。上述结果表明:改造的载体不仅可完全在DNA水平上操作,而且能正确表达外源基因和诱导细胞凋亡,为开展各种病原微生物的“自杀性”DNA疫苗研究提供了良好的工具。 展开更多
关键词 西门利克森林病毒复制子 “自杀性”DNA疫苗 表达载体 表达特性
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双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗载体的改造及其体外表达特性 被引量:2
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作者 谢京国 方六荣 +3 位作者 肖少波 姚林 潘永飞 陈焕春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期583-585,590,共4页
PCR扩增西门利克森林病毒(SFV)亚基因组启动子26S序列及人工合成Linker,将其插入基于SFV复制子的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA1的多克隆位点,获得含2个26S启动子并能同时驱动双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA2。为了验证p... PCR扩增西门利克森林病毒(SFV)亚基因组启动子26S序列及人工合成Linker,将其插入基于SFV复制子的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA1的多克隆位点,获得含2个26S启动子并能同时驱动双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA2。为了验证pSCA2的表达能力,PCR扩增绿色荧光蛋白基因EGFP和红色荧光蛋白基因DsRed2,分别插入pSCA2的2个26s启动子下游,获得EGFP和DsRed2双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗pSCA2-EGFP/RFP。将pSCA2-EGFP/RFP转染BHK-21细胞,转染后24h,可同时观察到被转染细胞发绿色荧光和红色荧光,证实EGFP和DsRed2均获得表达。 展开更多
关键词 西门利克森林病毒复制子 “自杀性”DNA疫苗 表达载体 双基因共表达
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吸水链霉菌应城变种10-22中一个复制子的克隆和基本复制区的定位
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作者 邓子新 周秀芬 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1990年第3期188-194,共7页
利用由pBR322衍生的链霉菌复制子探针载体pIJ2703,从吸水链霉菌应城变种菌株10-22中克隆了一段13kb的可以自主复制的DNA,制作了携带这段DNA的杂合质粒pHZ54的限制酶图谱。利用缺失、次级克隆等方法将基本复制区确定在2.86kb的范围内。... 利用由pBR322衍生的链霉菌复制子探针载体pIJ2703,从吸水链霉菌应城变种菌株10-22中克隆了一段13kb的可以自主复制的DNA,制作了携带这段DNA的杂合质粒pHZ54的限制酶图谱。利用缺失、次级克隆等方法将基本复制区确定在2.86kb的范围内。用外切酶Ⅲ顺序缺失法不仅进一步确证了基本复制区的位置,而且将其缩小到2kb的范围内。同时,在上述试验过程中、还组建了一系列既可在大肠杆菌、又可在变铅青链霉菌中复制的双功能质粒,其中有些质粒是有用的穿梭载体。 展开更多
关键词 吸水链霉菌 复制子探针 基本复制子
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复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用 被引量:1
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作者 李盼 张亮 +5 位作者 王宇 朱晓明 张巍 徐元基 于继云 阎瑾琦 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期765-768,共4页
目的为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc。方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc;化学法转染人胚肾293T细胞... 目的为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc。方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc;化学法转染人胚肾293T细胞,流式细胞术和免疫荧光法检测荧光素酶基因在293T细胞中的表达;利用基因电穿孔导入仪递送重组质粒至BALB/c小鼠股四头肌,活体成像仪动态观测荧光素酶基因在小鼠体内的表达。结果 pSVK-luc经相应酶切和测序鉴定,与预期设计完全一致。流式细胞术和免疫荧光检测均可见荧光素酶基因表达;同时活体成像仪也能检测到该基因在小鼠体内的表达。结论 pSVK-luc表达质粒的构建成功将为复制子DNA疫苗体内作用机制研究和体内电穿孔递送条件的优化奠定实验基础。 展开更多
关键词 荧光素酶基因 复制子载体 体内外表达 活体成像
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甲病毒载体的研究进展 被引量:2
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作者 龚文芝 刘灿 +1 位作者 张东东 宁宜宝 《中国兽药杂志》 北大核心 2015年第4期65-69,共5页
甲病毒属于披膜病毒科,是一类有包膜的单股正链RNA病毒。近些年来,国内外有关甲病毒载体的研究非常活跃,其已被用于疫苗研究、基因治疗以及分子生物学等研究领域。基于甲病毒载体的构造原理,将其分为三类,分别为复制完全型载体、复制缺... 甲病毒属于披膜病毒科,是一类有包膜的单股正链RNA病毒。近些年来,国内外有关甲病毒载体的研究非常活跃,其已被用于疫苗研究、基因治疗以及分子生物学等研究领域。基于甲病毒载体的构造原理,将其分为三类,分别为复制完全型载体、复制缺陷型载体和DNA/RNA载体。就这三类载体的改造过程进行了探讨,并对这三类载体的特点及其应用研究进展等方面进行了阐述,以期为开发出更安全、更有效的甲病毒载体提供参考。 展开更多
关键词 甲病毒 复制子载体 高水平表达
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一种含双歧杆菌种属特异性复制子的新型大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒的构建
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作者 石屹 杨业鹏 +4 位作者 李载权 周梅 李会娟 张志豹 李五岭 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期871-877,共7页
目前,双歧杆菌的转化是一个技术难题,与大肠杆菌等宿主菌的高转化效率不同,采用普通的原核质粒无法转化双歧杆菌.为此,本文提出双歧杆菌转化对质粒复制子具有"种属特异性"要求,并通过构建含有双歧杆菌特异复制子的新型穿梭质... 目前,双歧杆菌的转化是一个技术难题,与大肠杆菌等宿主菌的高转化效率不同,采用普通的原核质粒无法转化双歧杆菌.为此,本文提出双歧杆菌转化对质粒复制子具有"种属特异性"要求,并通过构建含有双歧杆菌特异复制子的新型穿梭质粒,以求解决这一难题.首先从GenBank获取长双歧杆菌隐性质粒pMB1的序列信息,采用Overlap-PCR方法获得其全长DNA,作为拟构建质粒的复制子;继而采用重组技术,将其与pMK4质粒片段(含大肠杆菌复制子pUC和抗氯霉素基因Cat)重组,构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒;用电穿孔法将重组质粒转化双歧杆菌,通过观察不同电转参数下的转化效率,选择双歧杆菌转化的最佳条件.结果,成功获得全长1899bp的pMB1复制子并构建成功含有pMB1和pUC双复制子的原核重组质粒,经酶切和测序鉴定正确,命名为pCMB1.以重组质粒成功转化了长双歧杆菌NCC2705和NQ1501,而其它3种野生型双歧杆菌(包括1株长双歧杆菌)未能转化成功.结论:质粒中含有双歧杆菌种属特异的复制子是实现双歧杆菌转化的必要条件;即使是含有特异复制子的质粒也只能转化有限数量种型甚至有限数量种株的双歧杆菌;选择最佳电转化条件能显著提高转化效率. 展开更多
关键词 双歧杆菌 复制子 穿梭质粒 转化
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柔嫩艾美耳球虫gam22基因重组质粒的免疫原性及保护效果
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作者 董青 王京森 +2 位作者 李新 王晓岑 李建华 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第9期6-11,共6页
为了评价重组质粒pSMART2b-Etgam22抗柔嫩艾美耳球虫的保护效果,本试验用PCR扩增获得Etgam22基因后连接至pSMART2b载体以构建重组质粒pSMART2b-Etgam22,用Western Blot分析重组质粒pSMART2b-Etgam22在293T细胞中的表达情况,用重组质粒pS... 为了评价重组质粒pSMART2b-Etgam22抗柔嫩艾美耳球虫的保护效果,本试验用PCR扩增获得Etgam22基因后连接至pSMART2b载体以构建重组质粒pSMART2b-Etgam22,用Western Blot分析重组质粒pSMART2b-Etgam22在293T细胞中的表达情况,用重组质粒pSMART2b-Etgam22免疫雏鸡,并检测抗体水平和细胞因子分泌情况,随后用柔嫩艾美耳球虫卵囊感染免疫的雏鸡,观察死亡情况,检测体重变化、卵囊数量、盲肠病变,通过抗球虫指数评价pSMART2b-Etgam22对柔嫩艾美耳球虫感染的保护效果。结果显示,本试验成功构建了重组质粒pSMART2b-Etgam22;Western Blot分析表明,该重组质粒可在细胞中表达融合蛋白,表达蛋白可被抗柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别。与未免疫感染组相比,pSMART2b-Etgam22免疫雏鸡显著提升了抗体水平(P<0.01)及IL-2和IFN-γ分泌(P<0.01),显著增加了体重(P<0.01),显著减少了卵囊排出数量(P<0.05),显著减轻了盲肠病变(P<0.05)。根据存活率、相对增重率、盲肠病变计分、卵囊值计算得出的抗柔嫩艾美耳球虫指数为165。结果表明,pSMART2b-Etgam22具有良好的抗柔嫩艾美耳球虫保护效果。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 Etgam22 甲病毒复制子载体 抗球虫指数 免疫原性 保护效果
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