建立检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2的mRNA相对表达水平的RT-qPCR方法

目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-RAA检测方法的建立及应用

为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法,对该方法进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,并分别采用该方法和实时荧光定量RT-PCR检测方法对72份猪淋巴结、肝脏等组织临床样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RT-RAA方法在41℃条件下反应20 min即可完成检测,对PEDV的最低检测限为1×10~1拷贝/μL;且仅能检测出PEDV,与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV-4)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)均无交叉反应;相同拷贝浓度的质粒标准品3次重复的扩增曲线几乎重合,起峰时间与荧光值没有明显差异。对72份临床样品进行检测,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。说明建立的实时荧光RT-RAA方法敏感性高,特异性和重复性良好,同时耗时短、操作简单,可用于PEDV的临床检测。

葡萄浆果内坏死病毒RT-q PCR检测技术建立及其在葡萄砧木中的时空分布规律

【背景】葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)是近年来在中国报道的一种正单链RNA病毒,该病毒发生普遍且危害严重。高灵敏的检测技术是病毒田间监测和无病毒苗木培育的关键。【目的】建立灵敏度较高的GINV逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测体系;明确不同葡萄砧木对GINV的敏感性;明确GINV在寄主植株中的时空分布规律,为该病毒的监测预警提供技术支撑。【方法】根据GenBank已登录GINV的复制酶(replicase,RP)、移动蛋白(movement protein,MP)和外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列设计6套引物,通过常规RT-PCR和RT-qPCR筛选特异性强、扩增效果好的引物。再通过对退火温度和引物浓度等反应条件的优化建立GINV的SYBR Green I染料法RT-qPCR检测体系,并进一步对该技术的灵敏度、特异性和田间适用性进行评价。将GINV接种到贝达、SO4、101-14、140R和1103P 5种葡萄砧木上进行症状观察和病毒检测,以筛选GINV敏感性较高的指示植物。基于所建立的RT-qPCR技术对接种GINV葡萄砧木的不同生长时期、不同部位样品进行GINV检测,从而明确GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。【结果】建立了GINV SYBR Green I染料法RT-qPCR检测技术体系,其最佳引物为GINVRPYGF2/R2,最佳引物浓度为300 nmol·L^(-1),最佳退火温度为58.4℃。该技术对GINV的检测特异性强,其检测灵敏度达常规RT-PCR的1 000倍。症状观察结果表明贝达感染GINV的症状最为严重,表现为叶片系统性坏死,而其他砧木叶片仅表现褪绿斑驳和环斑症状。RT-qPCR检测结果表明GINV在EL27时期(坐果期)的相对含量最高,5个品种间的病毒相对含量在EL12(花序分明期)和EL27时期间无显著差异,EL31时期(果实增大期)的贝达与SO4、101-14、140R和1103P的病毒相对含量存在显著差异;GINV的相对含量在不同组织部位存在较大差异,由高到低依次为下部叶片、上部叶片、上部茎秆、下部茎秆、根部。【结论】建立了灵敏度高、特异性强的GINV RT-qPCR检测方法,利用该方法明确了GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。

马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。

新型鹅呼肠孤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

2020年以来,在我国养鹅地区出现了一种由新型鹅呼肠孤病毒(Novel goose reovirus,NGRV)引起的以肝脾点状白色灶性坏死为主要病变特征的鹅传染性疾病。为了快速有效地检测NGRV,本试验针对禽呼肠孤病毒的λC基因设计引物和探针,建立了基于TaqMan探针荧光定量PCR方法,结果显示:该方法特异性强,对鹅细小病毒、坦布苏病毒、鹅圆环病毒、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒和鹅星状病毒等病原不存在交叉反应;该方法具有较高的敏感性,最低可检测限为56.6拷贝/μL,比常规PCR方法敏感10倍;该方法的重复性良好,组内和组间变异系数小于2%。对37份疑似新型鹅呼肠孤病毒病的临床样品检测结果显示,荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测出阳性样品均为13份,两者符合率为100%。测序结果表明,13份阳性样品均为NGRV。本试验成功建立了NGRV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,为新型鹅呼肠孤病毒病的流行病学调查和防控奠定了坚实的基础。

基于RT-thread的精确时间同步系统设计

分布式智能采集终端需要一致的时间基准,用于多种数据和事件的时间标记。为满足智能采集终端对高精度时间同步的需求,选择IEEE 1588精确时间同步协议实现时间同步;设计基于纯国产32 bit双核微控制器HPM6750和以太网收发器RTL8211FS(I)-VS的精确时间同步系统,选用国产开源嵌入式实时操作系统RT-thread操作系统,实现在物理层获取时间戳来运行IEEE 1588协议;构建测试平台对该时间同步系统进行主从时钟同步精度测试。测试结果表明,设计在物理层获取时间戳时达到的时间同步精度在±250 ns以内,与在数据链路层获取时间戳时达到±10μs的时间同步精度相比较,有效提高了时间同步精度,可广泛应用于对时间同步精度有较高要求的智能采集终端。

牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用

为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法,本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.998;该方法最低检出限为10拷贝/μL,与蜜蜂急性麻痹病毒等常见蜜蜂病毒无交叉反应,具有良好的灵敏性和特异性;组内和组间变异系数分别低于0.5%和2%,具有较好的稳定性。本研究建立的CBPV荧光定量RT-PCR检测方法,可用于实验室检测、流行病学调查和疫情监测。

实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用

目的探讨实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用效果。方法选取2021年12月—2022年12月盘锦市疾病预防控制中心接收的麻疹与风疹患者76例为研究对象,入院后所有研究对象均接受酶联免疫吸附试验法和实时荧光定量RT-PCR法检测,以检测患者恢复期血免疫球蛋白G(IgG)抗体水平(相对急性期是否4倍升高)为麻疹诊断金标准,对比两种检测方法的检测准确率、不同检测时间的阳性检出率。结果实时荧光定量RT-PCR法总诊断准确率为97.37%;酶联免疫吸附试验法中总诊断准确率为88.16%,比较两种方法的诊断准确率差异有统计学意义(P<0.05)。第1d,实时荧光定量RT-PCR法阳性检出率高于酶联免疫吸附试验法,差异有统计学意义(P<0.05)。第5d,实时荧光定量RT-PCR法阳性检出率低于酶联免疫吸附试验法,差异有统计学意义(P<0.05)。第2d、第3d、第4d实时荧光定量RT-PCR法和酶联免疫吸附试验法阳性检出率对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光定量RT-PCR对麻疹、风疹检测有一定诊断作用,可以有效提高检测准确率,同时操作简单,灵敏性较高,值得在麻疹与风疹病毒检测中推广。

基于RT-Thread的温湿度数据采集监测系统设计

温湿度数据的采集和监测在各行各业中发挥着重要作用。本文基于RT-Thread设计了一个分布式温湿度采集监测系统。该系统以STM32开发板为主控模块,在芯片中嵌入RT-Thread实时操作系统,可实时采集分布式节点的温湿度数据,并通过无线网络将数据上传至OneNET云平台。该系统提高了数据采集的实时性,实现了温湿度数据的可视化显示和远程实时监测功能。

金黄色葡萄球菌基因表达的DNA扣除法Real-time RT PCR相对定量分析

【目的】金黄色葡萄球菌作为一种分布广泛的致病微生物和研究革兰氏阳性菌遗传背景的模式菌株,利用real-time RT PCR对相关毒素及调控基因进行表达定量分析,在生物、医学、食品检测等领域具有较大研究价值。【方法】对制备好的反转录(RT,含有cDNA和DNA)和非反转录(RT—,仅含DNA)样品进行Real-time PCR检测,根据经典(1+E)—△△Ct相对定量算法并结合PCR效率公式建立一种基因表达相对定量分析的DNA扣除法,将得到的Ct值转换为各样品含量,从RT样品中扣除RT—样品的量,无需DNaseⅠ酶解处理就可以去除DNA的影响,RT—样品的检测结果还可同时作为稳定的DNA内参。【结果】采用以上方法分析金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(sea)、16S rRNA和RNAⅢ的表达情况,在含有葡萄糖的NB培养基中sea的相对转录水平随着葡萄糖浓度的增大而升高,RNAⅢ的相对转录水平随葡萄糖浓度的变化而产生小幅度的波动,16S rRNA在菌体生长初期时的表达量较为稳定;与绝对定量法比较,结果差异较小(均小于15%),且差异不显著(p>0.05)。【结论】这种基于DNA扣除法的Real-time RT PCR相对定量方法可以有效的对金黄色葡萄球菌的基因表达进行分析。

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。

Real-time TaqMan RT-PCR快速检测犬瘟热病毒方法的研究

按照犬瘟热(CDV)N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real-time荧光定量RT-PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用建立的Real-time荧光定量RT-PCR方法与常规RT-PCR以及韩国BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测。结果:用20pmol/mL的引物浓度各1uL和20pmol/mL的探针浓度0．3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感性高,可检测到1．24×10—3ng/uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数(CV)分别为2．3%、2．5%和4．2%;与常规RT-PCR和BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。

赤羽病病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为了研究赤羽病病毒的检测方法，试验根据GenBank中已发表的赤羽病病毒（Akabanevirus，AKAV）的s基因序列建立了检测AKAV的Real-timeRT—PCR方法。结果表明：该方法对AKAV的检测有高度的特异性，与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、传染性牛鼻气管炎病毒（IBRV）等13种病毒均无交叉反应；Real—timeRT—PCR能够扩增稀释度为1×10^-5的病毒RNA（核酸含量约1．18ng／μL），比普通RT—PCR高出1000倍；用此方法检测130份奶牛血清样品与1份流产胎儿病料，均未检测到阳性样本；AKAV在血清模拟样品中可被有效检出。

检测粪便中GGⅡ型诺如病毒Real-time RT-PCR方法的建立

诺如病毒是世界急性胃肠炎的重要病原之一。为加强其控制，通过序列比对设计出针对GGⅡ型诺如病毒保守序列的特异性引物与探针，建立了TaqMan Real-time RT-PCR方法。结果显示，此方法对诺如病毒核酸检测高度特异，与轮状病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒等无交叉反应，最低检出限可达10^2拷贝，线性范围为100～100拷贝，标准曲线的相关系数为-1．00。针对标准品质粒检测的批内实验变异系数为0．28％～1．63％（n=6）、批间实验为0．28％～1．05％（n=3），对同一样品分6次进行RNA提取和逆转录，其变异系数为3增8％。对212份临床腹泻标本分别用常规RT-PCR和本文建立的TaqMan Real-time PCR进行检测，发现后者检出率略高于前者。这些结果提示此研究建立的诺如病毒的TaqMan Real-time RT-PCR检测方法可用于临床腹泻粪便标本的检测。

鸡传染性支气管炎病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用

为定量检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)载量,建立IBV的Real-timeRT-PCR方法。用RT-PCR方法扩增出IBV的N基因片段,并克隆到pEASY-T3载体中,构建成含有N基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行SYBRGreenⅠReal-timePCR,建立了定量检测IBV核酸的标准曲线与直线回归方程,该方法显示:特异性强,检测下限至少达到5.58×102拷贝/μL,其重复性试验的变异系数小于3.2%;用建立的方法对实验接种IBVM41株的雏鸡组织中的病毒核酸进行了定量检测,检测结果显示:攻毒后肾脏中IBV含量高于支气管和肺脏,支气管和肺脏中病毒含量在攻毒后第3天高于攻毒后第7、10天,并证实临床表现与病毒载量之间存在密切关系。研究结果表明,建立的Real-timeRT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于IBV的定量检测。

利用real-time RT-PCR研究大型蚤对铜绿微囊藻毒素合成基因转录水平影响

近年来关于浮游动物与微囊藻相互作用的研究逐渐被关注,其中有的研究认为浮游动物能够诱导产毒细胞毒素含量的变化.微囊藻毒素是由微囊藻毒素合成基因编码翻译的,目前关于浮游动物对微囊藻毒素合成基因相对表达的影响并无报道,本文首次通过实时定量逆转录PCR方法研究铜绿微囊藻PCC7806产毒相关基因mcyB和mcyD在大型蚤胁迫下相对表达变化.结果显示微囊藻mcyB、mcyD基因相对表达均有上调,表明铜绿微囊藻PCC7806通过上调产毒基因的转录水平达到对大型蚤的诱导防御,从而为浮游动物与微囊藻相互作用研究提供新的依据.