一种快速筛选阳性克隆的方法——反向Northern印迹杂交技术

本实验采用反向Northern印迹杂交 (reverseNorthernblot)技术 ,对经反转录差异显示PCR(differentialdisplayre versetranscriptionalPCR ,DDRT PCR)获得的 5 6个差异片段 (cDNA)进行阳性片段的初步筛选 ,获得 8个候选阳性片段 ,经Northern印迹杂交实验 ,确证 5个阳性片段。实验表明该方法是一种快速检测和筛选阳性克隆片段的方法 ,并具有简便、经济的优点。它不仅可用于各种分离差异片段的方法中差异片段的初步筛选 。

奶牛乳房炎抗性基因的反向Northern斑点杂交差异筛选

分别用地高辛标记患乳房炎奶牛和健康奶牛外周血白细胞cDNA探针,对已构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库应用反向Northern斑点杂交技术进行差异筛选,筛选出的50个差异表达克隆测序后获得48个EST序列。根据在GenBank非冗余核酸数据库(nr)和EST数据库中Blastn序列比对结果,将这些EST分为3类:第一类代表已知基因,共35个;第二类代表已知EST,共5个;第三类为新EST,共3个。35个代表已知基因的ESTs按照基因功能分为八类:信号转导与细胞间通信(8.57%)、细胞结构与运动(11.43%)、细胞凋亡(5.72%)、细胞与机体防御(20.00%)、物质转运(8.57%)、翻译与表达调控(20.00%)、代谢(14.20%)及其它(11.43%)。结合相关文献初步探讨了部分患乳房炎奶牛外周血白细胞差异表达基因的功能和意义,其中BNBD5、IgJ、MIP-3、MnSOD、AHCY、WIP等基因可能在奶牛乳房炎抗性中发挥重要作用。

非同位素反向Northern筛选法

此文介绍了一种非同位素简单快速的反向Northern筛选方法。采用非同位素法标记探针,操作简便,不涉及污染环境。在杂交过程中采用三次校正,结果可靠,重复性好。该方法能有效地,高通量地验证差异表达基因。

反向Northern筛查冠心病血瘀证差异片段

目的 :降低mRNA差异显示假阳性。方法 :采用反向Northern杂交方法进行筛查差异片段的真实性。结果 :差异片段再扩增后经检测符合杂交条件的有 96条 ,反向杂交后 ,有 10条DNA片段属于真实的差异片段。结论

采用改进北方苍鹰算法的微电网优化调度研究

微电网系统通常由多种分布式电源组成,为降低运行成本,常使用智能算法对微电网进行调度。智能算法在求解微电网调度模型时容易陷入局部最优解,导致求解精度差,因此在北方苍鹰算法的基础上,提出了一种混合策略改进的北方苍鹰算法(HNGO),利用反向学习、Metropolies准则以及自适应t分布变异提高求解精度,同时构建了考虑可再生能源出力特性的需求响应模型,使负荷曲线与可再生能源出力曲线更贴近,然后建立日运行成本最低的微电网优化调度模型,并利用HNGO求解。对比仿真结果显示所提算法具有更好的求解精度,且所提需求响应模型能显著降低燃料成本。

奶牛乳腺组织乳房炎抗性基因反向Northern杂交鉴定

通过反向Northern对构建的文库进行进一步筛选,发现了43个ESTs,测序后得到40个质量合格的EST序列。EST分为3类,第1类代表已知基因,指与GenBank中的基因同源性大于80%、同源片段长度大于100 bp的EST,其中主要是蛋白编码序列,研究中发现的37个为已知基因;第2类代表已知EST,指与已知基因无同源性或同源性较低,但与dbEST库中的序列同源性大于95%、同源性长度大于100 bp的EST,研究中发现的3个为已知EST;达不到上述标准的EST归入第3组即全新的EST,研究未发现新的EST。对检索出的已知基因,从其功能上看主要参与细胞结构、代谢、凋亡、转运、信号传导、转录和翻译调控、机体防御等生命过程,表明这些基因涉及到抗病反应的全过程,包括病原识别的抗性基因、与信号传导和转录调控有关的基因、抗凋亡的基因。

反向 Northern Blotting 对绵羊卵巢组织差异表达ESTs的鉴定

利用地高辛DNA标记与检测技术反向Northern斑点杂交,对小尾寒羊和滩羊卵巢组织差异显示ESTs进行鉴定,避免同位素放射性污染,安全性很高且操作简单,提高了实验的准确性,一种鉴定差异显示ESTs简单而有效的方法。在研究基因表达、比较不同环境条件下动物组织的mRNA差异表达等方面具有广阔的应用前景。

基于改进北方苍鹰优化算法的多阈值图像分割

多阈值图像分割是一种简单、准确、高效且普遍的图像分割方法,相比单阈值图像分割更适用于包含大量信息的彩色图像。在多阈值图像分割中,随着阈值数量的增加,传统的枚举法计算量增大,分割一幅彩色图像不仅需要更多的时间,而且分割精度也随之降低。提出一种基于改进北方苍鹰优化(INGO)算法的多阈值图像分割方法。利用立方混沌优化与透镜成像反向学习策略增加种群多样性,在优化初始解的同时扩大种群搜索范围,使INGO算法尽可能搜索到潜在的最优解,增强算法的搜索能力。将最优最差反向与透镜成像反向学习策略相结合,避免INGO算法易陷入局部最优的情况,提高收敛精度。在对经典的伯克利测试图像进行多阈值彩色图像分割的实验结果表明,在GWO、PSO、ChOA等算法中,INGO算法取得峰值信噪比和特征相似度最优平均值的占比分别为100.000%和78.125%,在保证算法收敛效率的同时获得较优的图像分割结果,在多阈值图像分割领域具有较强的理论应用价值。

贫水高新区AM-OLED工业废水规模化回用工程实例

以北方某新兴产业示范园区AM-OLED面板生产企业排放的废水处理及回用工程为实例,介绍了AM-OLED废水的来源、处理及回用工艺、主要处理构筑物参数及运行效果。针对废水含有金属离子、有机溶剂、氟化物、SiO_(2)、高分子胺等较难去除物质的特点,采用反应沉淀+水解酸化+AAO+沉淀+过滤+臭氧氧化+活性炭吸附+超滤反渗透的组合工艺,反渗透淡水处理至满足AM-OLED企业回用水标准(浊度<5 NTU、COD<10 mg/L、BOD_(5)<2 mg/L、NH_(3)-N<2 mg/L、TP<0.2 mg/L、TDS<380 mg/L等)后回用,浓水经澄清+AAO+沉淀+过滤处理至满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918—2002)中一级A标准后排放。工程位于北方缺水地区,工程投产后,淡水产水率及出水水质稳定达到企业回用要求,为企业每日节约水费约8万元,浓水处理系统运行稳定,出水各项指标全面达标,具有较高的环境效益、经济效益和可持续发展潜力。

无核荔枝果实形成差异表达基因cDNA的克隆

采用抑制差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)分离与海南无核荔枝果实形成相关的差异表达基因的cDNA片段,为克隆相关基因提供研究基础。分别以无核荔枝的有核幼果为driver;无核幼果为tester,建立差减cDNA文库。经Reverse Northern Dot-Blot筛选该文库,共获得61个阳性克隆,随机选取17个克隆进行测序,共获得10条非重复序列,对其中较长的7个序列进行同源分析,结果表明:有6个序列在荔枝中为首次报道。

松辽盆地北部宋站-尚家地区断裂发育特征及其对油气成藏的控制作用

根据研究区基础地质资料,结合地震解释,研究了工区断裂的分布特征,发现断裂在平面上呈条带状分布。深、浅层展布方向具有一致性,主要以近南北向(尚家工区内)和北西向(宋站工区内)断层为主,近东西向断层最少;纵向上,发现断裂在T2(泉头组顶部)层发育最多,T3(登娄库组顶部)层最少。研究认为本区断裂发育分为早期、中期、晚期以及长期继承性发育这四个时期,其中以中、晚期断裂最为发育。分析表明本区断裂对油气藏的形成明显具有控制作用,控制了本区局部构造(断块)的发育,形成一系列构造油气藏、构造-岩性油气藏。断裂在活动时期可以直接作为油气运移的输导体,为油气的运移提供良好的时空配置;另一方面,断裂在封闭时期可以对储层形成侧向封堵,对油气起到了很好的保存作用。本文对研究区大量地震剖面进行了对比分析,发现由于反向正断层的侧向封堵作用,有利于该区油气的保存,对油气成藏明显具有控制作用。

SSH法获取水稻矮化突变体相关的cDNA片段

利用抑制性消减杂交 (Suppressivesubtractionhybridization ,SSH)分离水稻矮化突变体dwarf69与其野生型对照品系特光矮 2 (Oryzasativa ,TGA 2indica)间表达有差异的cDNA片段。分别以dwarf69作为驱赶子 ,TGA 2为检测子 ,以及以dwarf69作为检测子 ,TGA 2为驱赶子建立了两个差异表达cDNA文库 ,分别代表在TGA 2和dwarf69特异表达的cDNA。经反式Northern检测这两个文库共得到 1 0个阳性克隆。序列分析表明有两个序列为水稻中首次报道 ,一个序列有相应的基因组序列报道 ,但其cDNA序列是首次报道。

单眼视网膜摘除后鸽左右前脑基因的差异表达

利用消减抑制杂交 (SSH)技术分析左眼视网膜摘除后成鸽左右前脑基因差异表达情况 ,对 14个重组子经反Northern杂交去除假阳性 ,最终获得 4个阳性重组子 ,对阳性重组子进行克隆和测序 ,其中PFB/SSH 8片段长 2 2 6bp ,它的 138bp与人CaMⅠ基因外显子有 85 %的同源性 ;PFB/SSH 15片段长 2 5 2bp ,与nexinIalpha非表达序列有低的同源性 ;另外

用抑制消减杂交法分离巴西橡胶树胶乳特异表达基因

采用巴西橡胶树常割树胶乳的Poly(A+)RNA为Tester,叶片Poly(A+)RNA为Driver,通过抑制消减杂交法(suppressivesubtractivehybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库,通过菌落PCR及反式NorthernDot-Blot筛选鉴定阳性差异片段,获得79个胶乳特异表达阳性克隆,部分阳性克隆还通过NorthernBlot杂交及RT-PCR进一步验证。随机挑选部分阳性克隆序列比较分析,结果表明有部分克隆与巴西橡胶树中已知的基因相同,而多数克隆在巴西橡胶树中是新发现,它们与橡胶生物合成、物质代谢运输、信号传导和形态建成等相关。

鸭跖草Commelina communis中差异表达cDNA片段的克隆与分析

一种新的基因克隆技术称为抑制消减杂交技术(SSH)用于研究生长于2种生态环境(古铜矿山和正常土壤)中鸭跖草Commelina communis的基因表达差异。分别以Cu矿山鸭跖草作为检测子,非Cu矿山鸭跖草作为驱赶子,建立了生长于Cu矿山生态环境中鸭跖草的差异表达cDNA文库,此cDNA文库代表在Cu矿山鸭跖草中特异表达的cDNA。通过反式Northern杂交筛选出3个阳性克隆进行测序。序列分析表明其中一个cDNA为CaM-like基因。进一步对此基因进行Virtual Northern分析,结果初步表明此基因在生长于古铜矿山上的鸭跖草中上调表达。

mRNA差异显示阳性cDNA克隆的快速筛选与鉴定

建立了一种快速筛选差异显示阳性ｃＤＮＡ 克隆的方法， 该方法利用两轮Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交，结合质粒酶切图谱分析，从３０个ＤＤＲＴ差异ｃＤＮＡ片段中筛选鉴定出两个阳性ｃＤＮＡ克隆， 对其中一个克隆进行的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 分析证实了筛选方法的可靠性。

精制血府胶囊对缺氧缺糖心肌细胞一氧化氮合酶基因表达的影响

应用血清药理学、反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交等方法比较研究了精制血府胶囊、血府逐瘀胶囊、硫氮酮对缺氧缺糖培养心肌细胞一氧化氮合酶（ＮＯＳ）ｍＲＮＡ表达及乳酸脱氢酶（ＬＤＨ－Ｌ）、肌酸激酶（ＣＫ）、谷草转氨酶（ＧＯＴ）释放的影响。结果表明：三种药物均可显著提高缺氧缺糖心肌细胞ＮＯＳｍＲＮＡ的表达（Ｐ＜０．０１），且以精制血府胶囊最显著（Ｐ＜０．０１）。三种药物均可显著降低缺氧缺糖心肌细胞ＬＤＨ－Ｌ、ＣＫ、ＧＯＴ的释放（ｐ＜０．０１）。精制血府胶囊和硫氮 酮抑制ＬＤＨ－Ｌ的释放较血府逐瘀胶囊更为显著（Ｐ＜０．０１）。提示：三种药物均具有明显的心肌细胞保护作用，以精制血府胶囊和硫氮 酮为优，这种保护作用与其刺激心肌细胞生成一氧化氮（ＮＯ）有一定关系。

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定

[目的 ]探讨淡色库蚊细胞色素P45 0与溴氰菊酯抗药性的关系。 [方法 ]采用一对昆虫细胞色素P45 0简并引物 ,以反转录 聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段 ,T/A直接克隆法筛选阳性克隆 ,对新序列进行cDNA芯片和逆Northern分析。 [结果 ]从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得 112个阳性克隆 ,其中 2 4个阳性克隆测序后显示为细胞色素P45 0新序列 ,由GenBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等 4个亚家族 ;2 4个CYP4cDNA片段中 ,来自敏感品系的 2个片段(NYDS3和NYDS5 )和来自抗性品系的 4个片段 (NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17)在两品系间存在差别 ,cDNA芯片信号亮度值均是抗性品系大于敏感品系 ,倍数在 3 .1～ 9.7范围内 ;NYDR17仅与抗性探针杂交 ;逆Northern再鉴定 ,获得了与cDNA芯片一致的结果。 [结论 ]淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性相关 ;在淡色库蚊溴氰菊酯抗性机理中 ,可能存在P45 0基因点突变而导致的特异表达。

正交法整体优化差异显示反应体系

mRNA差异显示PCR(mRNAdifferentialdisplayPCR ,DDRT PCR)是分离差异表达基因的有效方法 ,但该方法的准确性极易受到外部因素和内部因素的影响。采用正交法优化DDRT PCR反应条件 ,充分考虑到模板浓度、锚定引物浓度、随机引物浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度以及Taq酶用量等因素在差异显示反应过程中的交互作用 ,一次PCR反应即可确定最佳反应组合。将筛选出的条件用于DDRT PCR ,得到差显结果假阳性率低 ,重复性和稳定性好 ,而且简化了反应条件的优选程序 ,这表明正交法是优化差异显示反应条件的理想方法。为了进一步简化整个差异显示反应系统的操作程序 ,降低假阳性率 ,研究采用了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)和银染显示差异带的方法 ,并用反向Northern法来验证回收条带 。

用DDRT-PCR技术克隆小鼠早期胚胎发育相关基因

mRNA差异显示 (DDRT PCR)技术在哺乳动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 ,因获得足够量的早期胚胎材料困难而受到限制 .通过对DDRT PCR技术各种条件参数进行优化组合 ,并对某些环节进行改良 ,以小鼠的MⅡ卵、2 细胞胚胎和 4 细胞胚胎为材料进行差异显示 ,仅以相当于5 0个卵细胞的量为起始材料 ,便得到了理想的差示结果 .从差异条带中挑取感兴趣的差异条带进行回收、阳性鉴定、亚克隆、序列分析、并在反向Northern杂交基础上设计了鉴定实验 .结果发现 ,有一个片段差异显著且是阶段性特异表达 .经GenBank检索 ,发现该片段仅有同源的EST ,其全长及功能尚不清楚 ,是一个功能未知基因 ,将该片段命名为ed1.反向Northern杂交结果表明 ,ed1在 2 细胞期胚胎中有表达 ,而在MⅡ卵及 4 细胞胚胎中均不表达 .