Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖与分化作用的初步研究

目的初步探讨Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖分化的影响。方法体外培养C2C12成肌细胞系.实验第一步分三组:A组:正常对照组,B组:1μM Reversine处理12h组,C组:1μM Reversine处理24h组。上述三组用Annexin-V/PI双染法处理C2C12成肌细胞并用流式细胞仪技术检测三组C2C12细胞凋亡的影响;实验第二步分五组:D组:正常对照组,E组:单独1μM Reversine处理7d,F组:单独成骨诱导7d,G组:1μM Reversine诱导12h+单独成骨诱导7d,H组:1μM Reversine诱导12h+1μM Reversine联合成骨诱导7d。上述五组光镜下观察细胞形态的变化,并通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测五组C2C12成肌细胞分化抑制因子(ID2),肌肉发生调节因子(Myogenin),生肌因子后结蛋白(Desmin)mRNA的表达。结果与A组相比,C组1μM Reversine处理24h能引起C2C12细胞明显的凋亡,B组1μM Reversine处理12h的C2C12细胞未见明显的凋亡。与D组相比,E组和H组的细胞增殖明显受到抑制,F组和G组细胞逐渐增殖并融合。结论 Reversine能够显著的抑制成肌细胞的增殖分化过程。

微波辐射下嘌呤C-2,6位衍生物及“Reversine”的合成

以2,6-二氯嘌呤为原料,微波辐射法合成了"Reversine"[1,2-(4-吗啉苯胺基)-N6-环己基腺嘌呤]的重要中间体2-氯-6-环己胺基嘌呤及其衍生物3b～3f,再以2-氯-6-环己胺基嘌呤为原料,微波辐射下合成了2-苯胺基-6-环己胺基嘌呤及"Reversine"。探索了合适的反应条件及影响因素,产物的结构通过1 H NMR进行了表征。研究表明,微波法可大幅提高合成嘌呤2,6位衍生物收率并缩短反应时间,为嘌呤衍生物及"Reversine"的合成提供了一种绿色、简洁高效的合成方法。

Reversine对高龄大鼠及肝纤维化大鼠的影响

目的探讨高龄大鼠与低龄大鼠肝脏衰老相关蛋白的表达差异及分析Reversine对不同年龄大鼠及肝纤维化大鼠的影响。方法年龄差异:将不同年龄F344大鼠分成低龄组、高龄组;分别给予药物干预,腹腔注射100μg/(kg·周)Reversine,分为低龄药物组和高龄药物组共4组。肝纤维化治疗:另取20只SD大鼠随机平均分为对照组、肝纤维化组、低浓度组(Reversine 50μg/kg)、高浓度组(Reversine 200μg/kg)。通过检测大鼠肝功能、病理染色观察大鼠肝脏形态以及免疫组化检测p16 INK4a、cyclin D1、TGF-β1、SMP30蛋白的表达。结果年龄差异各组F344大鼠的肝功能、肝脏组织形态及TGF-β1蛋白的表达无差异。实验结果提示SMP30蛋白的表达与年龄呈负相关,p16 INK4a的表达与年龄呈正相关。Reversine可下调高龄肝脏中p16 INK4a蛋白,并减少大鼠肝脏cyclin D1蛋白的表达。肝纤维化治疗结果提示Reversine可以通过降低肝纤维化大鼠肝脏α-SMA、TGF-β1蛋白的表达,减少胶原纤维的形成,达到减少肝纤维化程度的效果。结论p16 INK4a、SMP30蛋白可作为区分高龄肝脏与低龄肝脏的标记蛋白。Reversine可以通过下调高龄肝脏p16 INK4a蛋白,减少大鼠肝脏cyclin D1蛋白的表达。Reversine可以通过降低肝纤维化大鼠肝脏α-SMA、TGF-β1蛋白的表达,减少胶原纤维的形成,达到减少肝纤维化程度的效果,且不影响正常肝脏的功能,有可能开发成为延缓器官衰老的药物。

Reversine对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖和凋亡的调控及相关作用机制的研究

目的研究reversine对小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖和凋亡的影响,并探讨其相关作用机制。方法体外培养小鼠乳腺癌4T1细胞株,分别用不同浓度的reversine干预4T1细胞24、48 h,应用CCK-8法检测reversine对4T1细胞株的增殖抑制情况,计算半数抑制浓度IC50值;流式细胞术检测reversine对4T1细胞凋亡情况的影响;Western blot法检测细胞中Caspase-3、bax、bcl-2、TGF-β1、TIMP1和MMP9蛋白的表达情况。结果 CCK-8结果显示reversine可以抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖,并呈现时间剂量依赖关系。流式细胞检测结果显示低浓度组(10μg/m L)、中浓度组(25μg/m L)和高浓度组(50μg/m L)的细胞总凋亡率分别为(4.65±1.04)%,(11.68±0.69)%和(15.11±2.09)%;Western blot结果显示,应用reversine干预后,4T1细胞活化的Caspase-3表达增加(P<0.001),bax与bcl-2蛋白表达下降(P<0.001),bax/bcl-2比值增大(P<0.001),TGF-β1表达无差异(P>0.05),TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白表达下调(P<0.01)。结论 Re-versine可以抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖,诱导细胞凋亡,reversine可以通过TIMP1/MMP9通路抑制4T1细胞的增殖。

Reversine对肝星状细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的研究Reversine对肝星状细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响,进一步探讨Reversine防治肝纤维化的机制。方法体外培养HSCs细胞,分别给予不同浓度Reversine(5、10、20、40μg/mL)处理24 h后,采用CCK-8法检测Reversine对HSCs细胞增殖抑制率;流式细胞术检测Reversine对HSCs凋亡的影响;细胞免疫荧光法检测TGF-β1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3、Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白的表达情况。结果不同浓度Reversine(5、10、20、40μg/mL)明显抑制HSCs的增殖(38.03±9.05、44.97±5.85、55.33±2.40、64.19±3.66,F=27.356,P=0.000),且促进HSCs凋亡(13.14±1.87、15.85±1.00、20.57±0.90、21.24±1.07,F=298.75,P=0.000)。荧光显微镜显示Reversine作用HSCs后出现典型的细胞凋亡形态学改变,细胞体积变小,细胞质浓缩,细胞核固缩、碎裂,出现多倍体等,荧光定性检测发现TGF-β_1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3等蛋白有表达,Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白未见表达。结论 Reversine能抑制肝星状细胞的增殖,诱导其凋亡,并且影响肝星状细胞TGF-β_1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3等蛋白质的表达。

Reversine对人肝星状细胞系LX-2凋亡的影响

目的探讨Reversine对人肝星状细胞系LX-2凋亡的影响。方法设对照组和Reversine干预组,其中Reversine干预组分为7个浓度,分别为1,5,10,20,40,80,120μg/m L,CCK-8法检测Reversine对LX-2增殖的影响,选取最佳浓度。将细胞重悬在加入5μL FITC-Annexin V和5μL PI,用流式细胞仪进行了凋亡率分析,免疫荧光检测凋亡蛋白bcl-2及caspase 3。结果 Reversine可促进LX-2细胞凋亡,随着Reversine浓度增加,LX-2的凋亡可呈剂量依赖关系,其中10μg/m L为最佳浓度,LX-2细胞的bcl-2蛋白的表达显著下降而cleaved-caspase 3的表达显著上升。结论 Reversine可通过促进caspase-3蛋白活化、抑制bcl-2蛋白表达的方式诱导LX-2凋亡。

抗凋亡蛋白BRE、TNFR1和自体吞噬蛋白Beclin1在小鼠肝纤维化的表达及Reversine对其的影响

目的研究抗凋亡蛋白BRE、TNFR1蛋白和自体吞噬蛋白Beclin1在小鼠肝纤维化的表达,并观察Reversine对其表达的影响。方法 24只昆明小鼠随机分为6组:第1组不作任何处理;第2组皮下注射0.1 mLCCl4/oil2,4 h后处死取肝组织;第3组皮下注射0.1 mL CCl4/oil4,8 h后处死;第4组皮下注射0.1 mL CCl4/oil,每周2次,连续注射6周,停止用药后15 d处死;第56、组方法同第4组,停止注射CCl4后分别用Reversine 501、00mg/(kg.d)皮下注射15 d,15 d后进行免疫组织化学检测,对BRE、TNFR1和Beclin1 3种蛋白的表达进行分析。结果免疫组化结果发现BRE、TNFR1和Beclin1 3种蛋白在CCl4诱肝纤维化过程中的表达明显上升,而经过纤维化抑制剂Reversine的处理后3种蛋白的表达下降至正常小鼠肝的水平。结论 BRE、TNFR1和Beclin1 3种应激反应分子可能在肝纤维化与肝炎发病中起重要作用,它们有可能成为肝病诊断标志物和治疗肝脏疾病的重要靶点。

化学小分子reversine诱导细胞去分化的研究进展

目的总结目前将成体细胞转变成干细胞的常用技术,并对化学小分子reversine诱导细胞去分化的研究进展进行综述。方法查阅近年来关于成体细胞转变为干细胞及reversine诱导细胞去分化的相关文献,并进行总结分析。结果通过体细胞核转移技术、基因转染技术等方法将成体细胞转变成干细胞存在某些缺点,而reversine诱导细胞去分化具备独特优势,但其机制尚未完全明确。结论化学小分子reversine诱导细胞去分化有望成为诱导成体细胞转变为干细胞的主要方法。

逆转素对人肝癌细胞HepG2增殖、克隆形成及凋亡的影响

目的探讨逆转素(reversine)对人肝癌细胞HepG2细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响。方法人肝癌细胞HepG2经不同浓度reversine(0.1～1.6μmol·L^(-1))处理后,应用MTS法检测其对细胞增殖能力的影响;克隆形成实验评估reversine作用于肝癌细胞HepG2的远期效应;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测reversine处理后肝癌细胞HepG2的凋亡率;Western blot法检测凋亡相关蛋白PARP、Bax、Bcl-2及Bcl-xL表达水平的变化。结果与对照组(DMSO)相比,不同浓度reversine对人肝癌细胞HepG2的增殖均有抑制作用(P<0.05),且呈剂量依赖关系,IC_(50)为0.94μmol·L-1。Reversine可以明显抑制Hep G2细胞的克隆形成能力(P <0. 05),且较高浓度reversine处理后,Hep G2细胞几乎不能形成肉眼可见的细胞克隆; reversine可以诱导Hep G2细胞凋亡(P <0. 05),且细胞的凋亡率与reversine的浓度呈正相关; Western blot结果显示,reversine孵育48 h后,Hep G2细胞中活化PARP、Bax的表达明显上调;同时,Bcl-2及Bcl-xL蛋白的表达下降。结论 Reversine可以明显抑制人肝癌细胞Hep G2细胞的增殖和克隆形成能力,并且可诱导Hep G2细胞的凋亡,其诱导凋亡与线粒体凋亡途径相关。