RgpB通过抑制自噬小体与溶酶体融合避免Cx43降解参与食管癌化疗耐药

目的探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)的毒力因子RgpB在食管鳞癌化疗耐药中的作用机制。方法采用免疫沉淀-质谱联用技术筛选与Pg的毒力因子RgpB互作的自噬调节因子;运用免疫共沉淀实验探索RgpB和自噬调节因子TBC1D5之间的相互作用;采用蛋白免疫印迹法测定Pg感染对食管癌细胞膜受体分子Cx43表达的影响;使用细胞免疫荧光检测Lamp1、Cx43与TBC1D5的关系;利用自噬双荧光观察Pg感染对自噬小体与溶酶体融合的影响;使用平板克隆及CCK-8法检测Pg感染及Cx43抑制剂在使用化疗药后对食管癌细胞系增殖作用的影响。结果免疫沉淀-质谱联用技术筛选出与RgpB互作的自噬调节因子TBC1D5;免疫共沉淀结果显示,Pg分泌的毒力因子RgpB可与自噬调节因子TBC1D5直接结合并相互作用;蛋白免疫印迹法结果显示,感染Pg后食管癌细胞膜Cx43表达量高于未感染组(P<0.05);细胞免疫荧光结果显示,在感染Pg后,Cx43在细胞膜表面的表达量增加(P<0.05);stubRFP-sensGFP-LC3自噬双荧光结果显示,在Pg感染时,自噬体与溶酶体融合受到阻断;平板克隆及CCK-8法结果显示,使用化疗药后,Cx43抑制剂能够逆转Pg感染对食管癌细胞系的促进作用。结论Pg入侵食管癌,其毒力因子RgpB阻碍自噬小体与溶酶体融合,从而使膜受体分子Cx43免受溶酶体降解,导致食管癌化疗耐药。

牙龈卟啉菌蛋白酶基因rgpA与rgpB蛋白酶区的克隆和表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)rgpA、rgpB蛋白酶区,构建rgpA、rgpB蛋白酶区原核表达系统。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从PgATCC33277菌株中扩增rgpA、rgpB蛋白酶区,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET42a的rgpA/rgpB蛋白酶区表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导其表达。结果所克隆的PgATCC33277菌株rgpA、rgpB基因蛋白酶区的核苷酸序列与报道的相应核苷酸序列同源性分别为98.9%、99.0%,氨基酸序列同源性分别高达99.2%、99.1%。pET42a-rgpA/rgpB-E.coli BL21DE3系统的蛋白表达量为细菌总蛋白的60%左右。结论本研究成功地构建PgrgpA、rgpB蛋白酶区高效表达系统,为测定RgpA、RgpB免疫原性及作用提供前提。

龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌牙龈素基因片段的检测

目的:检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P．gingivalis)的2个基因片段kgp-cd和rgpB-cd,探讨2个基因片段的存在和缺失与牙周临床指标之间的关系。方法:选择慢性牙周炎患者龈下菌斑84个,对P．gingivalis阳性的龈下菌斑样本进行kgp-cd和rgpB-cd基因片段检测;根据2个基因片段的有无,将P．gingivalis分为A型和B型,采用SPSS11．5统计软件包,用t检验和X2检验分析不同基因型P．gingivalis与牙周临床指标的关系。结果:A型P．gingivalis在慢性牙周炎中的检出率高于B型(P<0．05),分别为85．29％和14．71％。不同基因型P．gingivalis引起的牙周袋探诊深度和牙龈出血倾向存在显著性差异(PD:t=2．85,P<0．05;BOP:P<0．05)。结论: kgp-cd和rgpB-cd基因与P.gingivalis的致病性有关。

慢性牙周炎伴冠心病患者动脉粥样硬化斑块中牙龈卟啉单胞菌牙龈素基因片段与牙周临床指标的相关性

目的探讨慢性牙周炎伴冠心病患者动脉粥样硬化斑块中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingival-is,P.gingivalis)牙龈素中2个基因片段kgp-cd和rgpB-cd的存在和缺失与牙周临床指标之间的相关性。方法收集54例伴慢性牙周炎冠心病患者的冠状动脉粥样硬化斑块,对其中P.gingivalis阳性的斑块样本进行kgp-cd和rgpB-cd基因片段检测;根据2个基因片段的有无,将P.gingivalis分为A型和B型,采用SPSS11.5统计软件包,用t检验和χ2检验分析不同基因型P.gingivalis与牙周临床指标的关系。结果 A型P.gingivalis的检出率高于B型(P<0.05),分别为84.21%和15.79%。动脉粥样硬化斑块中P.gingivalis的不同基因型所引起的口腔牙周袋探诊深度和牙龈出血倾向存在明显差异。结论在冠状动脉粥样硬化斑块中检出慢性牙周炎相关致病菌P.gingivalis,提示慢性牙周炎相关致病菌在冠心病的发生、发展中可能起着重要的作用;kgp-cd和rgpB-cd基因与P.gingivalis的致病性可能有关。

伴慢性牙周炎冠心病患者动脉粥样硬化斑块中牙龈卟啉单胞菌牙龈素基因片段检测

目的检测伴慢性牙周炎的冠心病患者动脉粥样硬化斑块中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)牙龈素的2个基因片段kgp-cd和rgpB-cd,探讨2个基因片段的存在和缺失与牙周临床指标间的关系。方法 54例伴慢性牙周炎冠心病患者,对其中P.g阳性的冠状动脉粥样硬化斑块进行kgp-cd和rgpB-cd基因片段检测。根据2个基因片段的有无,将P.g分为A型和B型,分析不同基因型P.g与牙周临床指标的关系。结果 A型P.g的检出率(84.21%)高于B型(15.79%)(P<0.05);A、B 2种基因型引起的口腔牙周袋深度和探诊出血指数比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论慢性牙周炎相关致病菌在冠心病的发生、发展中可能起重要作用,kgp-cd和rgpB-cd基因与P.g的致病性有关。