乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。

重组人内抑素的抗肿瘤活性

目的 观察重组人内抑素抗肿瘤活性及对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法 用人癌裸鼠移植性肿瘤及小鼠移植性肿瘤模型对重组人内抑素进行抗肿瘤药效学观察 ,用MTT法观察其对血管内皮细胞及肿瘤细胞增殖的抑制作用。结果 重组人内抑素 ,可明显抑制人胃癌BGC80 3和人乳腺癌B37裸鼠移植性肿瘤的生长 ,对小鼠肝癌H2 2实体瘤亦呈一定的抑制作用。MTT试验结果显示重组人内抑素可抑制人胎脐静脉血管内皮细胞ECV30 4的增殖 ,对人结肠癌HCT 8等肿瘤细胞的增殖无影响。结论 重组人内抑素具有较强的抗肿瘤作用 ,其作用机理可能与抑制血管内皮细胞增殖、抑制肿瘤新生血管形成有关。

液质联用鉴定重组人血管内皮抑制素

目的:用液质联用技术鉴定重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin)。方法:利用 ESI-Q-TOF-MS 法测定 rhEndostatin的精确相对分子质量,通过 HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 法测定其胰蛋白酶酶切后肽段的部分氨基酸序列并结合数据库检索进行结构鉴定。结果:重组人血管内皮抑制素的实测相对分子质量为21114.5,与理论相对分子质量21113.8相比非常接近。HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 测定 m/z 802.0的肽段的部分氨基酸序列为 Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu。将其 m/z 和氨基酸序列在 MASCOT 数据库检索,结果表明重组人血管内皮抑制素的结构正确。结论:液质联用是鉴定蛋白质的灵敏、快速、准确的新方法。

重组人内皮抑素PEG-PE胶束的制备及抑瘤效应研究

目的:内皮抑素是强效的血管内皮细胞生长抑制剂,但其低溶解度限制了临床应用,通过采用聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)制备包载重组人内皮抑素的胶束,以期寻找内皮抑素的新药物载体。方法:研究PEG-PE内皮抑素胶束的理化性质,观察PEG-PE内皮抑素胶束对体外肿瘤细胞生长的作用及对鸡胚绒毛尿囊体内血管生长的影响。结果:制备的PEG-PE-内皮抑素胶束的粒径为(48.32±8.29)nm,Zeta电位为+3.2 mV。包封率为75%,该胶束可以抑制MCF-7肿瘤细胞的生长和增殖,内皮抑素浓度50μg.mL-1时抑制率为31.4%,对鸡胚绒毛尿囊血管新生也有明显的抑制作用。结论:同单独用内皮抑素比较,用PEG-PE胶束作为药物载体运送内皮抑素直接抑制肿瘤细胞生长和抑制新生血管形成的效果更明显。

重组人血管内皮抑素联合化疗治疗胃癌腹膜转移的临床研究

目的:观察重组人血管内皮抑素注射液(恩度)联合化疗治疗胃癌腹膜转移的有效性和安全性。方法:选取70例胃癌腹膜转移的患者,随机分为研究组(n=36)和对照组(n=34)。研究方案:两组均接受多西他赛75 mg/m^2静脉化疗,替吉奥胶囊(1.25 m^2<体表面积<1.5 m^2,50mg/次;体表面积≥1.5 m^2,60 mg/次,2次/d;连续14 d)口服,同时顺铂40 mg/m^2腹腔灌注化疗。研究组在顺铂腹腔灌注前3 d联合恩度60 mg/次,腹腔灌注第1、3天。评价不良反应,每2个周期评价治疗效果,化疗直至疾病进展或毒性不能耐受,最多治疗6个周期。结果:两组均无完全缓解患者,研究组部分缓解率25.0%(9/36),疾病稳定率55.6%(20/36),疾病控制率80.6%(29/36),对照组部分缓解率17.6%(6/34),疾病稳定率32.4%(11/34),疾病控制率50.0%(17/34),研究组疾病控制率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.007)。研究组中位无进展生存时间、中位总生存时间均优于对照组,差异均有统计学意义(P=0.009、0.023)。两组各不良反应发生率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),均无化疗相关死亡。结论:恩度联合化疗可提高治疗胃癌腹膜转移的效果,延长生存期,不增加明显不良反应。

重组人血管内皮抑素联合卡铂方案对非小细胞肺癌术后近期疗效及血标志物的影响

目的探讨重组人血管内皮抑素（恩度，Endostar^TM）联合多西紫杉醇和卡铂（TP）方案术后辅助治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的疗效及对外周血标志物的影响。方法采用重组人血管内皮抑素联合TP方案（治疗组）和单用TP方案（对照组）治疗Ⅰb-Ⅲa期的NSCLC术后患者各18例，观察近期疗效、并检测治疗前后外周血循环血管内皮细胞（CEC）数量及肿瘤标志物CEA、NSE、CYFR21-1的水平。结果外周血CEC及CEA、NSE、CYFR21—1治疗后均有下降，第4周期治疗后治疗组的CEC和NSE与对照组比较差异有统计学意义（P=0．016和P=0．013）。治疗组无病生存时间延长，但尚无统计学意义。复发、转移患者CEC明显升高，经治疗病情好转后下降。结论重组人血管内皮抑素联合TP方案术后辅助治疗NSCLC较单纯化疗显示近期疗效上的优势、长期生存结果值得期待。CEC可能是一个较好的预测疗效的指标。

重组人血管内皮抑素联合顺铂治疗恶性胸膜腔积液的疗效

目的评价重组人血管内皮抑素联合顺铂(DDP)胸腔内灌注治疗恶性胸腔积液的有效性和安全性。方法大量的胸腔积液的患者40例,置细管引流,尽可能排出积液后,随机分为试验组和对照组,每组20例,试验组每次胸腔内给予重组人血管内皮抑制素30 mg,联合DDP 20～60 mg.m2,间隔1周复查仍有胸腔积液,可再次给药。对照组单用DDP 20～60 mg.m2,方法与试验组相同。参照WHO浆膜腔积液疗效评价标准及RECIST非靶病灶评价方法,评价客观疗效和药物不良反应。结果 40例患者胸腔积液引流量平均为2200 mL,积液均呈暗红色浓血性;平均每例用药1.8次,均可进行客观疗效评价。试验组缓解(CR)6例,部分缓解(PR)11例,稳定(SD)2例,病情进展(PD)1例,客观有效率(RR)85%,疾病控制率(DCR)95%;对照组CR 3例,PR 9例,SD 6例,PD 2例,RR 60%,DCR90%,2组疗效比较试验组优于对照组(P<0.05)。治疗期间无白细胞、血小板及血红蛋白下降等血液毒性反应。结论在胸腔细管引流的基础上,重组人血管内皮抑素联合DDP灌注治疗恶性胸腔积液安全有效,能够改善患者的生活质量。

重组人内皮抑素工程菌发酵条件的优化

重组人内皮抑素(rhEndostatin)是人内皮抑素经过基因突变获得的新的蛋白质序列,是一种血管生成抑制剂类蛋白,具有抗肿瘤活性。实验对蛋白rhEndostatin产生菌E.coliBL21(DE3)的基本发酵条件进行了研究并用正交试验对培养基成分进行了优化,优化后的培养基组成为:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,葡萄糖0.5%,NaCl 0.2%,Na2HPO4.12 H2O 1.5%,KH2PO40.2%,(NH4)2SO40.2%,MgSO4.7 H2O 0.02%,VB15 mg/L,VB21 mg/L,微量元素:CoCl2.6 H2O 5 mg/L,MnCl2.4 H2O,H3BO3,Na2MoO4.2 H2O,AlCl3.6 H2O,Ferric citrate均20 mg/L。优化后的培养基在发酵罐发酵,湿菌重达到45 g/L以上,目的蛋白产量达324 mg/L,为rhEndostatin的进一步研究开发打下了基础。

重组人血管内皮抑素的阳离子交换色谱复性与纯化条件研究

对rhEndostatin包涵体蛋白的色谱复性条件进行研究,摸索出最佳的复性、纯化条件,解决其在大肠杆菌中表达提取时遇到的蛋白变性问题。按实验条件对表达的rhEndostatin包涵体蛋白进行提取、洗涤、变性;利用正交法设计重组蛋白的色谱复性、纯化实验;利用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱对rhEndostatin包涵体蛋白进行了色谱复性、纯化。最佳复性条件为rhEndostatin上样浓度为2.5 mg/mL,洗脱体积流量为1/20床体积/min(3.5 mL/min),NaCl浓度0.1 mol/L,GSH/GSSG的浓度比为3/0.3 mmol/L。在此条件下纯度约97%,蛋白回收率为90%,重组蛋白的活性最高,IC50达到5μg/mL。