rhTNF-α在体外对人正常精子线粒体和质膜的影响

目的:观察rhTNF-a在体外对人正常精子线粒体功能和质膜完整性的影响。方法:40例健康自愿者正常精液,Peroll梯度离心将精子密度调整为10×106/mL,分别与终浓度0 pg/mL(对照组)、30 pg/mL、60 pg/mL、90 pg/mL、270 pg/mL的rhTNF-a孵育。在0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h时间段取样,用终浓度为10 mg/mL 的Rh123和PI双染色精子,流式细胞仪检测精子线粒体膜电位及质膜完整性的变化。结果:与对照组相比较,60 pg/mL、90 pg/mL、270 pg/mL各组线粒体功能良好的精子明显减少,这种变化趋势与TNF-a浓度和孵育时间呈正相关(P <0.01)。30 pg/mL组的精子线粒体功能与对照组相比无统计学差异(P >0.05);30 pg/mL、60 pg/mL、90 pg/mL、270 pg/mL各组的PI和Rh123双染色均阳性的精子数较对照组多,且与rhTNF-a的浓度和孵育时间呈正相关(P <0.01)。结论: rhTNF-a对人精子线粒体功能有一定的影响,提示有可能干扰精子的能量代谢,降低精子受精能力,并有可能通过线粒体凋亡途径,促进精子凋亡;同时影响精子质膜的完整性。

rhTNF-α生物活性测定方法的改进及其对人白血病早幼粒细胞HL-60作用机理研究

目的:通过对rhTNF-α生物活性方法的改进,建立了较规范的活性测定方法,避免了人为判定的误差,提高了测定精确性.方法:本研究应用L929鼠结缔组织来源纤维母细胞系,参照国际标准品测定rhTNF-α效价.分别用Northern Dot Blot杂交检测及DNA电泳等方法,观察不同效价rhTNF-α对HL-60人白血病早幼粒细胞生长的影响.结果:rhTNF-α对HL-60细胞的生长抑制作用与时间、剂量正相关,核酸水平检测初步发现c-myc基因表达量降低,且rhTNF-α对DNA有损伤作用.结论:rhT-NF-α的测定可用自动分析的方法进行.rhTNF-α抑制HL-60细胞生长,其机理不同于阿霉素.

rhIL-1α和rhTNF-α对人成纤维滑膜细胞PGE_2受体和Gαs的影响及芍药苷的作用

目的探讨rhIL-1α和rhTNF-α对人成纤维样滑膜细胞(FLS)PGE2受体(EP2)及Gαs表达的影响及芍药苷(Pae)的作用。方法体外培养人FLS,使用不同浓度的rhIL-1α和rhTNF-α刺激人FLS,观察EP2及Gαs蛋白表达的情况,观察Pae对其的影响。采用免疫荧光标记法结合激光共聚焦显微镜分析技术检测人FLS的EP2表达,Western blot检测Gαs表达。结果 rhIL-1α(0.1、1、10μg/L)和rhTNF-α(0.2、2、20μg/L)明显降低人FLS EP2和Gαs表达,Pae(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)可上调人FLS的EP2和Gαs表达。结论 Pae恢复rhIL-1α和rhTNF-α刺激后EP2和Gαs的表达可能是其抑制滑膜细胞增殖和亢进分泌功能的分子机制之一。

冷冻切除联合rhTNF-α在恶性脑胶质瘤中的应用价值探讨

目的探讨冷冻切除联合rhTNF-α在恶性脑胶质瘤中的临床应用价值。方法选择颅内胶质瘤患者90例,随机分为两组,每组45例。对照组使用冷冻治疗,观察组在对照组的基础上联合使用rhTNF-α,比较两组患者治疗后新增语言、运动及记忆力障碍比例,治疗不良反应及治疗前及治疗后6个月肿瘤体积的变化。结果观察组治疗后新增语言、运动及记忆力障碍的比例均显著低于对照组(P<0.05),观察组发生发热和头痛的比例显著低于对照组(P<0.05)。治疗6个月后,两组肿瘤体积均较治疗前显著缩小(P<0.05),且观察组小于对照组(P<0.05),观察组2年生存率高于对照组。结论冷冻治疗联合使用rhTNF-α治疗脑胶质瘤,在减少单纯冷冻治疗不良反应的同时,提高治疗效果延长患者生存时间,值得临床推广。

冷冻联合rhTNF-α对C6大鼠脑胶质瘤细胞的凋亡诱导和增殖抑制作用

目的探讨冷冻联合rhTNF-α对C6大鼠脑胶质瘤细胞凋亡的影响及对肿瘤生长的抑制作用。方法建立大鼠脑胶质瘤模型,待肿瘤长至第15天,随机将荷瘤鼠分为4组:G1、G2、G3、G4分别为盐水组、冷冻治疗组、rhTNF-α治疗照组及联合治疗组,同时分别行相应的治疗。于治疗后第15天取材,以TUNEL法与流式细胞仪联合检测肿瘤细胞的凋亡,采用免疫组化观察PCNA的表达,计算抑瘤率。结果联合治疗组肿瘤细胞凋亡情况与其他各组相比有显著差异(P<0.01),PCNA的表达明显减少(P<0.01),且该组对肿瘤生长的抑制率(60.38%)明显大于冷冻组(42.69%)和TNF-α组(21.68%),且大于理论抑瘤率(55.11%)。结论冷冻和rhTNF-α对C6大鼠脑胶质瘤细胞的生长均有抑制作用,同时可诱导其凋亡,两者联用抗肿瘤作用进一步加强,具有协同作用,可能成为胶质瘤治疗的一种新策略。

抗rhTNF-α单克隆抗体F(ab′)_2片段的制备

采用胃酶消化抗ｒｈＴＮＦ－αＭｃＡｂ制备了其Ｆ（ａｂ′）２片段。对胃酶消化的时间，酶／抗体的比例及片段回收率等条件做了比较。结果显示，胃酶在ｐＨ４．２于３７℃消化１８ｈ，可制备出完整的Ｆ（ａｂ′）２片段；非还原型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ发现，有９０％以上的ＩｇＧ被降解为Ｆ（ａｂ′）２片段；Ｓ－２００层析柱纯化Ｆ（ａｂ′）２片段的回收率达４５％；双抗体夹心竞争抑制ＥＬＩＳＡ法测定Ｆ（ａｂ′）２片段的竞争抑制效价为２．６×１０７。中和Ｌ９２９细胞毒活性试验的结果表明，１４８ｎｇ的Ｆ（ａｂ′）２片段可中和１个单位ｒｈＴＮＦ－α的细胞毒作用。

冷冻切除联合rhTNF-α治疗脑胶质瘤的临床观察

目的探讨冷冻切除联合重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)治疗脑胶质瘤的效果。方法对18例脑胶质瘤患者采用冷冻切除联合rhTNF-α治疗。观察rhTNF-α毒副作用,出院前及以后每6个月复查一次MRI评估治疗效果。结果肿瘤全切除17例,1例次全切除。术前9例有病变对侧肢力减退者,均在1周内恢复。rhTNF-α常见的毒副作用为发热、局部红肿及肌肉疼痛等,发生率为38.9%(7/18)。术后随访6～20个月,除1例次全切者术后15个月死亡外,余17例均幸存。结论本结果提示冷冻切除联合rhTNF-α治疗脑胶质瘤可能成为胶质瘤治疗的一种新策略。

Effect of rhTNF-α on Mitochondrial Transmembrane Potential and Motility of Human Sperm in vitro by Flow Cytometry and Computer Aided of Semen Analysis

To evaluate effect of recombined human tumor necrosis factor （rhTNF- α） on mitochondrial transmembrane potential and motility of human sperm in vitro Methods Semen samples for study were obtained from 40 health men （average age 26 ± 1.2 years） with normal semen analysis. Sperm suspension with computer aided of semen analysis （CASA） technique; 2） were stained in the presence of 10 μg/ml Rh123 and PI, mitochondrial transmembrane potential of those was analyzed by flow cytometry （FCM）. Results Significant differences were found between experimental groups and control groups on viability, straight line velocity, curvilinear velocity, average path velocity, progressive motility of human sperm and number of sperm with normal mitochondrial transmembrane potential （P〈0.01） expect final concentration 30 pg/ml group （P〉0. 05）. Sperm motility lowed with increasing rhTNF-α concentration and incubating time （P〈0. 01）. Number of sperm with normal mitochondrial transmembrane potential decreased with increasing rhTNF-α concentration and incubating time （P〈0.01）. Conclusion rh TNF-α can decrease human sperm motility function in vitro, which can interfere the function of human sperm mitochondrial transmembrane potential and may inhibit sperm mitochondrial enzymatic activities.

静脉注射小剂量rhTNF-α对烫伤大鼠T淋巴细胞功能的影响

将ＳＤ大鼠９０只随机分体内和体外实验组，体外实验又分为假伤，烫伤和ｒｈＴＮＦ－α治疗组，观察重组人肿瘤坏死因子－α（ｒｈＴＮＦ－α）对烫伤大鼠Ｔ淋功能的影响。结果表明，小剂量静脉注射ｒｈＴＮＦ－α可以改善烫伤大鼠脾脏Ｔ淋巴细胞亚群的分布，并使Ｔｈ／Ｔｓ比值高（Ｐ＜０．０５），Ｗ３／２５（Ｔｈ）数量增加，ＯＸ－８（Ｔｓ）数量减少；体外实验表明，ｒｈＴＮＦ－α可以改善Ｔ淋巴细胞对ＣｏｎＡ的反应能力。

表达载体pRSET C重组rhTNF-β的表达及其纯化

将hTNFβN端缺失23个氨基酸的基因,克隆在表达载体pRSETC的6个组氨酸序列和肠激酶酶切位点序列的下游。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,rhTNFβ获得了高表达,表达量占细菌总蛋白的26%。其表达产物大部分以可溶性形式存在。菌体裂解上清经0.45μm滤膜过滤后,用固定化金属配体亲和柱层析,纯度可达95%左右;经肠激酶酶切后,具有TNFβ的细胞毒活性,此活性为9.8×109U/g。

rhTNF-α对人精子凋亡率和膜表面肿瘤坏死因子受体Ⅱ表达量影响的实验研究

目的：研究重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）在体外对人精子凋亡率和精子膜表面肿瘤坏死因子受体Ⅱ（TNFR-Ⅱ）表达量的影响，探讨rhTNF—α在体外对人精子质量影响的作用机制。方法：26例检验合格精液标本经Percoll液洗涤处理，Ham，sF10液将精子密度调整为10x10。／ml，每份标本各取3m1分装于两支无菌试管（1．5ml／管），分为空白对照组和实验对照组两组，每组26份标本。空白对照组试管内不加rhTNF—α，实验对照组加入终浓度为270μg／ml的rhTNF-α，置37℃、5％CO2培养箱孵育2h，然后用流式细胞仪分别检测两组的精子凋亡率和精子膜表面TNFR-Ⅱ表达量，每份标本均检测10000个精子，比较两组精子凋亡率和TNFR-Ⅱ表达量的差异。结果：实验对照组与空白对照组人精子凋亡率分别为8．28％和5．07％，人精子膜表面TNFR-Ⅱ表达率分别为52．09％和73．79％，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论：rhTNF-α体外作用后使精子凋亡率明显升高，膜表面TNFR-Ⅱ的表达量明显降低，TNF-α与精子膜表面受体结合后可能促使精子凋亡而影响精子的质量。

IFN-γ联合rhTNF-α抑制白血病细胞c-myc原癌基因的表达

据《中华内科杂志》1994年33卷第5期报道西安第四军医大学西京医院血液科,用干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）与人白血病细胞株及急性髓细胞性白血病（AML）患者原代白血病细胞体外液相共育,用细胞总RNA样品与32P标记的c-myc DNA探针打点杂交,观察了IFN-r联合TNF-α作用HL-60细胞,TNF作用病人原代白血病细胞对其c-myc癌基因表达的影响。

聚乙二醇存在下的离子交换层析纯化重组人肿瘤坏死因子

采用离子交换层析纯化了大肠杆菌表达的重组人肿瘤坏死因子（rhTNF－α），考察了PEG在离子交换层析中的作用，包括PEG分子量和浓度等的影响，初步探索了PEG和蛋白质相互作用机理。少量残余的杂蛋白继以疏水相互作用层析除去，获得了比活性为3．21×107u·mg-1的rhTNF－α，纯化倍数为253，总回收率为91．3％。

重组人TNF-α诱导乳腺癌细胞ZR75-1凋亡及其机制的初步研究

背景与目的:肿瘤坏死因子α(TNF-α)是抗肿瘤活性较强的细胞因子,是重要的抗肿瘤生物治疗制剂之一,但由于其对人体有较严重的副作用,临床应用受到了限制。为了降低其毒副作用,同时保留其抗肿瘤能力,TNF-α的突变体——突变型471TNF-α应运而生。本研究对重组人突变型471rhTNF-α与野生型rhTNF-α蛋白的抗肿瘤能力进行了比较,并对突变型471rhTNF-α诱导ZR75-1细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究。方法:以乳腺癌细胞系ZR75-1为靶细胞,以基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析100"g/L突变体471rhTNF-α与100"g/L野生型rhTNF-α作用ZR75-1细胞12h,肿瘤细胞发生凋亡的情况;利用以ELISA为基础的TransAMTMNF-κBp65试剂盒检测10μg/L、50μg/L和100μg/L突变体471rhTNF-α或野生型rhTNF-α作用ZR75-1细胞4h后核因子NF-κB的活化情况。结果:2%琼脂糖凝胶电泳显示,突变体471rhTNF-α处理组的ZR75-1细胞基因组DNA呈现明显的“ladder”状分布,野生型rhTNF-α处理组的“ladder”条带明显减弱;流式细胞仪分析显示,突变型471rhTNF-α诱导的凋亡峰面积为(44.6±3.6)%,野生型rhTNF-α诱导凋亡峰面积占(24.7±2.7)%,两组差异具有显著性(P<0.05);从细胞周期结果来看,突变型471rhTNF-α处理组G1期细胞占(66.6±4.2)%,比例明显高于对照组[(34.8±3.1)%]与野生型hTNF-α[(46.2±3.8)%],S期细胞占(33.2±2.9)%,比例明显低于对照组[(50.1±3.8)%]与野生型hTNF-α处理组[(45.7±2.9)%],G2期细胞比例为(0.2±0.1)%,明显低于对照组[(15.1±2.2)%]和野生型hTNF-α处理组[(8.1±3.1)%],而野生型hTNF-α处理组与对照组相比均无明显变化(P>0.05)。NF-κB活化检测结果显示,50"g/L野生型rhTNF-α处理ZR75-1细胞4h后NF-κB的活化量(A值为3.27±0.1)明显高于突变型471rhTNF-α处理组(A值为1.51±0.2)。结论:突变型471rhTNF-α比野生型rhTNF-α具有更强的诱导ZR75-1细胞凋亡的能力;ZR75-1细胞内NF-κB活化明显受限是突变型471rhTNF-α诱导凋亡能力增强的主要原因之一。

α-型重组人肿瘤坏死因子衍生物的稳定性研究

应用体外细胞毒实验对2种α－型重组人肿瘤坏死因子衍生物生物学效优的稳定性进行了考察。结果表明，这2种制品对温度和光照都比较敏感，受热后其生物学活性迅速下降。但在一20℃存放1a后，活性光明显变化。建议该2种制品应在低温条件下避光贮存。

突变型与野生型TNF-α诱导肿瘤细胞的凋亡

目的比较重组人突变型471rhTNF-α(mt471rhTNF-α)与野生型rhTNF-α(wt rhTNF-α)诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力,并对mt471rhTNF-α诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究.方法以乳腺癌细胞系ZR75-1细胞为靶细胞,应用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt471rhTNF-α与wt rhTNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的情况;利用以ELISA为基础的Trans AMTM NF-κB p65试剂盒检测经mt471rhTNF-α或wt rhTNF-α处理的ZR75-1细胞核因子NF-κB的活化情况,以便对其诱导凋亡的机制进行初步的研究.结果20g/L琼脂糖凝胶电泳显示,mt471rhTNF-α处理组的ZR75-1细胞基因组DNA呈现明显的ladder状分布,wtrhTNF-α处理组的“ladder”条带明显减弱;流式细胞仪分析显示,mt471rhTNF-α诱导的细胞凋亡峰面积高于wt rhTNF-α处理组.NF-κB活化检测结果显示,当两型rhTNF-α浓度增高到50μg/L时,wt rhTNF-α处理组的NF-κB的活化量明显高于同浓度的mt471rhTNF-α处理组(P=0.002).结论mt471rhTNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于wt rhTNF-α;肿瘤细胞内NF-κB活化明显受抑是mt471rhTNF-α诱导凋亡能力增强的主要原因之一.

重组人肿瘤坏死因子对鼻咽癌细胞生长抑制的研究

目的：研究重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ－α）对鼻咽癌细胞株ＣＮＥ３生长的抑制作用。方法：应用ＭＴＴ比色法，选择ＣＮＥ３细胞生长指数期，检测ｒｈＴＮＦ、ｒｈＩＬ－２（重组白介素－２）单用或合用在不同剂量、不同时间的抑制作用。结果：ｒｈＴＮＦ－α与ＣＮＥ３细胞培养２４ｈ，抑制率仅有９．３８％。当作用时间延长到７２ｈ，抑制率达到３０．７％。用量由４０ｕ／２×１０５细胞增加到５０００ｕ／２×１０５时，对ＣＮＥ３细胞的生长抑制率也由３．３５％增长到３３．８％。结论：ｒｈＴＮＦ－α对鼻咽癌细胞的生长的抑制作用有时相和剂量的依赖关系。ｒｈＴＮＦ与ｒｈＩＬ－２合用对ＣＮＥ３细胞生长的抑制有叠加作用。

rhTNF－α对AML原代白血病细胞c－myc原癌基因表达的影响

采用细胞总ＲＮＡ斑点杂交技术，以￣３２Ｐ标记的ｃ－ｍｙｃＤＮＡ片段为探针，研究了８例急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）原代白血病细胞ｃ－ｍｙｃ原癌基因的表达及其径小剂量重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ－α）处理后ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ水平的变化。结果发现：全部８例病人的骨髓细胞均呈Ｃ－ｍｙｃ高表达，其中６例经５０ｕ／ｍｌＴＮＦ诱导处理１２小时后，其ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ水平发生显著降低，另２例的抑制程度较轻。结果证明ＴＮＦ对ＡＭＬ原代白血病细胞ｃ－ｍｙｃ表达具有明显的抑制作用，从而预示ＴＮＦ在ＡＭＬ诱导分化治疗应用的潜在有效性。

人脐血CD34^＋细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的采用脐血CD34^＋细胞在rhGM—CSF、rhTNF—α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞。方法应用CD34^＋干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34^＋细胞，用rhGM—CSF、rhTNF—α联合诱导分化发育14d，成为成熟DC，观察细胞形态及检测CD83分子表达。结果50ml脐带血可分离出CD34^＋细胞约1．1×10^6，在rhGM—CSF、rhTNF-α诱导下CD34^＋干细胞培养2周，约扩增10～20倍。CD34^＋干细胞培养第3d开始出现集落，第8～9天集落最大，CD34^＋千细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC，表面分子CD83阳性率为81．7％。结论体外联合运用rhGM—CSF、rhTNF—α，能够成功诱导脐血CD34^＋细胞分化为大量成熟的DCs。

大肠杆菌表达的重组人肿瘤坏死因子的分离纯化

目的 对表达在大肠杆菌里的重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ－α）进行分离纯化。方法 采用疏水相互作用层析和离子交换层析。结果 考察了影响疏水相互作用导析纯化的因素，优化了层析操作条件；样品经疏水相互作用层析后，少量残余的杂蛋白可通过离子 交换层析除去。结论 获得了比活性为２．８９×１０＾７ｕ／ｍｇ的ｒｈＴＮＦ－α，总回收率为４０．６％。