缓释rhVEGF的PDLLA/nHA复合多孔支架制备及血管诱导活性研究

目的研究制备消旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(PDLLA/nHA)多孔支架复合并缓释重组人血管内皮细胞生长因子(rhVEGF165),并观察其诱导血管形成的生物特性,为进一步实验提供理论依据。方法将rhVEGF165与PDLLA溶液物理混匀,用冷冻相诱导分离法制备PDLLA/nHA复合多孔支架,制成直径3 mm、高8～10 mm圆柱状支架。电镜观察其结构特点,检测在缓释rhVEGF的PDLLA/nHA支架降解过程中rhVEGF释放量,绘制释放曲线。分离培养兔骨髓间充质干细胞(BMSC),接种于复合和未复合rhVEGF的PDLLA/nHA支架。将细胞支架复合物植入兔大腿肌袋中,4周后取出材料行vWF免疫组化染色,观察新生血管形成情况。结果每个缓释rhVEGF的PDLLA/nHA支架含rhVEGF 4μg,材料孔径为20～100μm,孔隙率约90%,孔径联通性好。免疫组化及新生血管密度检测显示缓释rhVEGF支架+BMSC(rhVEGF-PDLLA/nHA+BMSC,VPB组)新生血管密度较空白支架(PDLLA/nHA,P组)之差异非常显著(P<0.001),较空白支架+BMSC(PDLLA/nHA+BMSC,PB组)之差异显著(P<0.05)。结论缓释rhVEGF的PDLLA/nHA多孔支架的结构特点适合细胞生长,有较强的血管诱导活性,是血管化组织工程的理想材料。

骨髓基质干细胞联合rhVEGF治疗肢体缺血的实验研究

目的研究骨髓基质干细胞移植联合rhVEGF对兔肢体缺血的治疗效果。方法手术制作兔后肢缺血模型,之后将骨髓基质干细胞和/或rhVEGF注射到局部缺血组织中,对照组注射生理盐水。结果移植后2周、4周各组微血管计数比较,均为P<0.05,差别有统计学意义。移植后2周、4周缺血组织中VEGF蛋白的变化:各组间比较,P<0.05,差别有统计学意义。结论骨髓基质干细胞移植联合rhVEGF治疗肢体缺血效果显著,骨髓基质干细胞移植促进VEGF分泌,而后者反过来促进干细胞向血管内皮细胞分化,形成新生微血管,加快侧枝循环网络的重建,增加缺血组织血流灌注。

rhBMP_2与rhVEGF联合用药对大鼠成骨细胞及跖骨的作用

目的观察rhBMP2(重组人骨形成蛋白-2)与rhVEGF(重组人表皮生长因子)联合用药对体外培养SD大鼠成骨细胞不同成熟阶段的增殖、分化及胎鼠跖骨生长的影响。方法分离新生大鼠颅盖骨的细胞培养获得前成骨细胞(preosteoblast,pOB),再诱导分化为成骨细胞(osteoblast,OB),以rhBMP2和低(2μg/L)、中(4μg/L)及高(8μg/L)剂量rhVEGF干预48 h,比较乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞相对增殖率(RGR)和碱性磷酸酶(AKP)活性。另取胎鼠跖骨,以rhBMP2和rhVEGF干预7d和14 d,比较其纵向骨生长率(longitudinal bone growth rate,LBDR)。结果①LDH组间差异无统计学意义。②RGR:pOB的中、高剂量联用组较同剂量rhBMP2组高。OB的中、高剂量联用组较同剂量rhBMP2及rhVEGF组高。③AKP:pOB的中、高剂量联用组较同剂量rhBMP2及rhVEGF组高。OB的组间差异无统计学意义。④LBDR;7d联用组较rhBMP2及rhVEGF组高,但14d联用组差异无统计学意义。结论适量联用rhBMP2与rhVEGF对骨再生诱导及骨组织早期生长有协同促进效应。

rhVEGF_(165)在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达、纯化及其生物学活性

利用哺乳动物细胞表达系统,稳定表达和纯化高生物学活性的人重组血管内皮生长因子(VEGF165)蛋白。将VEGF165克隆于表达载体pCDNA4.0,与T-GS载体共同转染CHO-S(中国仓鼠卵巢细胞)细胞,MSX(Methionine sulphoximine)加压筛选高表达细胞株,5 L发酵罐培养,细胞培养上清液通过三步纯化得到rhVEGF165蛋白,通过Western blotting、Biacore和人脐静脉内皮细胞增殖实验等对表达蛋白的特异性、亲和力及生物学活性等进行检测。所建立的细胞株其rhVEGF165蛋白表达量约50 mg/L,纯化后纯度达到90%以上,细胞活性EC50为1.94 ng/mL。成功筛选到高表达rhVEGF165的CHO细胞株,纯化得到高活性、高亲和力的rhVEGF165蛋白。

重组人VEGF_(165)工程菌的发酵及表达产物的纯化与活性测定

目的 :优化重组人VEGF1 65(rhVEGF1 65)工程菌的发酵条件 ,分离纯化目的蛋白并检查活性。方法 :考察了甲醇诱导浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响 ;发酵液经离心、透析后 ,经肝素亲和柱层析、超滤制得纯品 ;采用CAM实验和血管内皮细胞MTT法测定生物活性 ,比较了与人VEGF1 65标准品的免疫原性。结果 :最佳表达条件为 :甲醇诱导浓度为 1% ,诱导时间为 5～ 6d ;采用Heparin SepharoseCL6B亲和层析后 ,产物纯度可达 90 %以上 ;活性测定结果显示 ,目的蛋白具有促血管生成作用 ;与人VEGF1 65具有相似的免疫原性。结论 :经发酵纯化后获得了有活性的重组人VEGF1

hVEGF165基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人血管内皮生长因子(hVEGF)基因VEGF165片段,构建pcDNA3.1/hVEGF165,观察其在COS-7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。方法从合法引产的胎儿心肌组织中提取总核糖核酸(RNA),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,聚合酶链反应(PCR)法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his-B中,构建pcDNA3.1/hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS-7细胞,蛋白印迹(Westernblotting)法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果用RT-PCR方法从胎儿心肌组织中获得了正确的hVEGF165基因序列,并成功构建pcDNA3.1/hVEGF165,且实现转染COS-7细胞的瞬时表达。结论构建的pcDNA3.1/hVEGF165转染真核细胞COS-7能够表达rhVEGF蛋白。

VEGF对兔骨髓细胞分化形成破骨细胞的诱导作用

目的:观察血管内皮生长因子(VEGF)对兔骨髓细胞分化为破骨细胞的诱导作用。方法:应用终未浓度为5 ng/mL的人重组rhVEGF体外诱导培养兔骨髓细胞,并与骨片共同培养,分别于诱导培养后3、6、9 d用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色进行破骨细胞鉴定计数和骨片吸收陷窝数目的统计。结果:诱导培养3 d,实验组与对照组的破骨细胞数和骨吸收陷窝数无显著性差异(P>0.05),而随着诱导培养时间延长,实验组两者的数量明显增加,在诱导培养6 d和9 d时,均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VEGF具有体外诱导骨髓细胞形成破骨细胞的作用。

重组人VEGF基因治疗大鼠缺血TRAM皮瓣的观察

目的 研究重组人VEGF基因对大鼠缺血TRAM皮瓣成活的影响 ,探讨基因治疗缺血皮瓣的可能性及疗效。方法 动物实验分 4组 ,实验组每只皮下注射PcDNA3 1VEGF 5 0 0 μg ;阳性对照组每只注射VEGF 10 0ng;空白对照组每只注射生理盐水 1ml;阴性对照组每只注射PcDNA3 15 0 0μg。用ELLSA法及免疫组化法测定VEGF基因表达水平 ,测定皮瓣成活面积及皮下组织中微血管密度 ,观察该基因对皮瓣成活的影响。结果 实验组皮瓣成活面积及切片微血管密度显著高于阴性对照组及空白对照组 (P <0 0 5 ) ,与阳性对照组差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。免疫组化显示实验组中有大量棕褐色抗原抗体复合物沉积在小血管内皮细胞胞浆内。结论 直接皮下注射PcDNA3 1VEGF ,可在注射部位表达具生物活性的VEGF ,促进皮下微血管形成 ,提高缺血TRAM皮瓣的成活面积。