弓形虫Rhomboid-1蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)Rhomboid-1(TgROM1)蛋白。方法收集、纯化弓形虫速殖子,用Trizol法提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增TgROM1基因,回收的PCR产物与pMD18-T载体连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-TgROM1。将重组克隆质粒亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-TgROM1并转化至Rosetta感受态,用IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功克隆了643bp的TgROM1基因,双酶切鉴定重组表达质粒pGEX-4T-1-TgROM1构建正确。SDS-PAGE检测重组表达质粒表达的TgROM1蛋白分子质量约为48ku,Western blot检测表明该蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论成功克隆了弓形虫ROM1基因并原核表达了具有反应原性的重组TgROM1蛋白,为该蛋白的功能研究奠定了基础。

微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫Rhomboid基因部分序列的克隆和分析

目的获得我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因(CPRho和CARho)部分序列并确定与国外分离株相应序列的同源性。方法应用RT-PCR技术扩增微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因片段,然后将其克隆到pMD18-T载体中,测得序列应用DNAMAN软件进行序列分析。结果经RT-PCR扩增出微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,大小均为723 bp。经DNA MAN软件分析,表明我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid核苷酸序列同源性为99.6%,氨基酸同源性为99.2%。二者与GenBank公布的相应序列核苷酸同源性分别为99.9%和99.7%,而氨基酸同源性均为99.6%。结论获得了微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,为继续研究该基因的侵入功能等奠定了基础。