Chinese1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的构建弓形虫Chinese 1基因型Tg Ct Wh3(以后均简称Wh3)株棒状体蛋白(rhoptry protein,ROPs)16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至p MD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3D结构。结果各组均PCR扩增出约2.1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以p ET-28a和p EGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。

弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白对小鼠子宫基质细胞蜕膜化的影响

目的探讨弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白对妊娠小鼠子宫基质细胞蜕膜化的影响。方法原代培养小鼠子宫基质细胞,用雌二醇、孕酮和cAMP体外诱导蜕膜化的同时加入ROP16重组慢病毒,72 h后qRT-PCR检测蜕膜化标志物催乳素(PRL)mRNA的表达,流式细胞术检测蜕膜细胞凋亡率的变化,并用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平。结果提取的小鼠子宫基质细胞纯度为95%以上,在体外诱导蜕膜化后,PRL mRNA的表达随时间延长而显著升高(P<0.05),在诱导的蜕膜细胞中过表达ROP16Ⅰ/Ⅲ,相比于对照组,蜕膜细胞的凋亡率降低(P<0.01),凋亡蛋白Bax表达降低,Bcl-2蛋白表达上调。结论弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白会抑制蜕膜细胞的凋亡,可能会影响蜕膜细胞增殖与凋亡的平衡,从而影响胚胎的植入。

ROP16过表达对THP-1诱导分化巨噬细胞极化的影响

目的探讨弓形虫棒状体蛋白(ROP16)对人外周血单核细胞(THP-1)诱导分化巨噬细胞极化的影响。方法构建ROP16过表达慢病毒载体转染THP-1细胞,筛选得到稳转细胞系,使用佛波脂诱导分化为巨噬细胞,RT-PCR和Western blot分别检测相关mRNA及蛋白的表达情况。结果构建ROP16过表达载体,并转染THP-1筛选得到稳定过表达细胞系,佛波脂诱导分化为THP-1源性巨噬细胞。Western blot结果显示,M1型巨噬细胞的标志性蛋白一氧化氮合酶(iNOS)表达量升高,M2型巨噬细胞的标志型蛋白精氨酸酶-1(Arg-1)表达量降低(P均<0.05)。RT-PCR的结果显示,ROP16过表达组iNOS、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达均高于空载体组和阴性对照组(P均<0.05);Arg-1、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达均低于空载体组和阴性对照组(P均<0.05)。结论弓形虫ROP16在THP-1分化巨噬细胞内过表达后可诱导细胞向M1型巨噬细胞方向极化。

刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)、棒状体蛋白18(TgROP18)复合基因真核表达重组质粒,并验证其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒pVAX1-ROP16与pVAX1-ROP18分别经EcoRⅠ和NotⅠ、NheⅠ和AflⅡ双酶切,将ROP16与ROP18基因先后克隆至双启动子真核表达载体质粒pVAXD的多克隆位点中,构建pVAXD-ROP16-ROP18重组质粒。分别用双酶切和PCR验证正确的重组质粒及对照组质粒转染Hela细胞,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板进行ROP16基因、ROP18基因与管家基因β肌动蛋白基因的RT-PCR扩增,采用间接免疫荧光法检测各自基因的表达。结果重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18经PCR及双酶切鉴定构建正确。转染后经RT-PCR检测,实验组与对照组β-肌动蛋白基因扩增产物均与预期大小相符,实验组ROP16基因、ROP18基因扩增产物分别为1 700bp和2 100bp,与预期大小相符,而对照组均未扩增出ROP16及ROP18基因。间接免疫荧光法检测显示,重组质粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18转染组细胞可见绿色荧光,空质粒及对照组无绿色荧光。结论成功构建了重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,该质粒可在真核细胞中表达。

刚地弓形虫ROP16蛋白对MH-S细胞极化和凋亡的影响及其相关机制

目的 探究刚地弓形虫棒状体蛋白16 (ROP16)在小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)中的表达及其对细胞极化和凋亡的影响和相关机制。方法利用携带绿色荧光标签的ROP16过表达慢病毒转染MH-S细胞,构建稳定表达ROP16的ROP16-MH-S细胞株(过表达组),同时设空载体慢病毒转染对照组(空载体组)和无转染对照组(对照组)。转染72 h后免疫荧光法检测ROP16-MH-S中ROP16的表达及其在细胞中的定位。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的转录水平为内参照,RT-qPCR检测ROP16-MH-S细胞中促炎(M1)因子白细胞介素-1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、 IL-18、 IL-6、 IL-12和抗炎(M2)因子IL-10、转化生长因子-β(TGF-β),以及抑凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)和促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase 3)、 Caspase 9等mRNA的相对转录水平;Western blotting检测ROP16-MH-S细胞中极化蛋白精氨酸酶1 (Arg-1)、信号转导和转录激活因子3 (STAT3)、 705位点磷酸化(pTyr705)-STAT3、 STAT6、 pTyr641-STAT6和凋亡蛋白Caspase 9、 Caspase 3、 Bcl-2、 Bax蛋白的相对表达水平;流式细胞术检测ROP16-MH-S细胞的凋亡情况。组间比较采用单因素方差分析。结果转染后72 h,空载体组和过表达组90%以上的细胞可见较强的绿色荧光,过表达组细胞中可见明显红色荧光聚集在ROP16-MH-S细胞核及其周围。RT-qPCR结果显示,过表达组ROP16 mRNA的相对转录水平为8 023.459±39.325,高于空载体组(5.540±0.001)(F=83 188, P <0.01);Western blotting检测结果显示,过表达组ROP16蛋白的相对表达水平为16.349±0.746,高于空载体组(1.291±0.333)(F=831.7, P <0.01)。RT-qPCR结果显示,过表达组促炎(M1)因子IL-1β、 TNF-α、 IL-18、IL-6、 IL-12 m RNA的相对转录水平分别为0.495±0.002、 0.337±0.007、 0.378±0.014、 0.474±0.035和0.730±0.021,均低于空载体组(0.994±0.043、 1.165±0.034、 0.943±0.005、 1.153±0.028、 0.926±0.031)(F=261.7、 536.5、 1 682.0、 225.0、 78.5, P <0.01);抗炎(M2)因子IL-10、 TGF-β mRNA的相对转录水平分别为7.013±0.032和1.608±0.024,均高于空载体组(0.790±0.031、 1.091±0.027)(F=23 835.0、 200.1, P <0.01)。Western blotting检测结果显示,过表达组Arg-1、 pTyr705-STAT3、 pTyr641-STAT6蛋白相对表达水平分别为2.337±0.089、 3.471±0.046、 3.905±0.045,均高于空载体组(0.871±0.014、 1.482±0.071、 1.514±0.050)(F=640.8、 1 608.0、 3 528.0, P <0.01)。流式细胞术检测结果显示,过表达组细胞凋亡率为(2.990±0.042)%,低于对照组(6.480±0.071)%和空载体组(5.655±0.290)%(F=219.7, P <0.01)。Western blotting检测结果显示,过表达组促凋亡蛋白Bax、 Caspase 3、 Caspase 9的相对表达水平分别为0.558±0.005、 0.640±0.011、0.593±0.026, Bax/Bcl-2为0.453±0.011,均低于空载体组(0.991±0.010、 0.926±0.006、 0.963±0.012、0.834±0.008)(F=2 850.0、 1 200.0、 359.3、 2 337.0, P <0.01)。RT-qPCR检测结果 显示,过表达组促凋亡基因Bax、 Caspase 3、 Caspase 9 mRNA的相对转录水平分别为0.588±0.086、 0.563±0.025和0.403±0.014, Bax/Bcl-2为0.158±0.008,均低于空载体组(0.924±0.016、 0.937±0.041、 0.807±0.032、 0.779±0.014)(F=24.7、 78.6、 154.9、 265.5, P <0.01);过表达组抑凋亡基因Bcl-2 mRNA的相对转录水平为3.702±0.362,高于空载体组(1.186±0.006)(F=104.1, P <0.01)。结论 ROP16蛋白在ROP16-MH-S细胞中(主要位于细胞核及其周围)稳定表达,可激活STAT3、 STAT6,磷酸化Tyr705-STAT3、 Tyr641-STAT6,进而调控细胞向M2极化,抑制细胞凋亡。

刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体蛋白16的分泌与分布

目的观察刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)不同毒力株的棒状体蛋白16(ROP16)在入侵宿主细胞过程中的分泌及分布。方法以刚地弓形虫RH株速殖子c DNA为模板,PCR扩增Tgrop16基因,克隆至p ET-32a(+)载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组蛋白Tg ROP16经纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗Tg ROP16多克隆抗体,用蛋白质印迹(Western blotting)和间接ELISA检测抗Tg ROP16多克隆抗体的特异性和敏感性。用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测刚地弓形虫RH株和Pru株速殖子Tgrop16基因的转录水平,Western blotting分析RH株和Pru株Tg ROP16蛋白的表达量。用间接免疫荧光(IFA)检测弓形虫RH株和Pru株速殖子在入侵人包皮成纤维细胞(HFFs细胞)过程中,Tg ROP16蛋白在宿主细胞中的分泌与分布。结果制备的抗Tg ROP16多克隆抗体,Western blotting分析结果显示,能与重组蛋白Tg ROP16结合,在相对分子质量(Mr)约100 000处有一特异性条带;间接ELISA检测结果显示,抗体效价为1∶25 600。实时荧光定量PCR检测结果显示,Pru株Tgrop16基因表达量(7.786±0.206)是RH株(1.000±0.110)的7倍(P<0.05)。Western blotting分析结果显示,RH株中Tg ROP16蛋白表达量(Tg ROP16与其内参Tg Tubulin的灰度比值为0.373)较高于Pru株(Tg ROP16与其内参Tg Tubulin的灰度比值为0.232)。IFA检测结果显示,RH株和Pru株速殖子在入侵HFFs细胞前,Tg ROP16蛋白定位于速殖子的顶端复合体,速殖子入侵HFFs细胞后,Tg ROP16蛋白显示在虫体外。结论制备的抗Tg ROP16多克隆抗体特异性和敏感性高;刚地弓形虫RH株速殖子的Tg ROP16蛋白表达量高于Pru株的;两株速殖子在入侵HFFs细胞前,Tg ROP16蛋白分布于速殖子顶端复合体,在入侵宿主细胞过程中被分泌出虫体。